化学品+啮齿类动物神经毒性试验方法.doc

ICS 13300：11100A 80a园中华人民共和国国家标准GBT 2 1 787-2008化学品 啮齿类动物神经毒性试验方法Chemicals-Test method of neurotoxicity study in rodents20080512发布 2008090 1实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局学者 中国国家标准化管理委员会厘111GBT 21787-2008刖置 本标准等同采用经济合作与发展组织(OECD)化学品测试指南No424(1997年)啮齿类动物神经毒性试验(英文版)。 本标准做了下列编辑性修改：增加了范围；计量单位改为我国法定计量单位；删除了OECD的参考文献部分。 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SACTC 251)提出并归口。 本标准负责起草单位：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。 本标准参加起草单位：上海出入境检验检疫局、宁波出入境检验检疫局。 本标准主要起草人；邱璐、刘清君、李朝林、陈小青、李霜、林振兴。GBT 2 1787-2008OECD引言1OECD化学品试验指南根据科学技术的发展进行定期审查，从而使危害识别和产生的相关数据 与科学进步保持充分的一致。OECD成员国、OECD秘书处以及国际科学团体可提出建立或更新试验 指南。建立试验指南的程序指导文件见OECD环境专题No76。21990年3月在华盛顿召开的神经毒性试验的OECD专题会议产生了本试验指南草案的建议，1992年2月在巴黎召开了关于系统性短期和(迟发的)神经毒性的专家工作组协调会议。在这些会议 提出的建议和美国环保局神经毒性指南基础上提出了本草案。1995年3月在加拿大渥太华由OECD 神经毒性特设工作组提出最终的建议稿。工作组综合考虑了OECD指南项目的协调成员以及加拿大 对神经毒性试验指南的建议。3本试验指南可获得化学品是否引起成年动物潜在神经毒性作用的信息，并可进一步确定潜在神 经毒性特征。它既可以与现有的重复剂量毒性试验联合，也可单独进行。进行以本试验指南为基础的 试验设计，尤其是在对本指南中常规观察项目和试验程序进行修改时，推荐参考OECD关于神经毒性 试验策略和方法的指导性文件。OECD指导性文件也便于在一些特殊情况下选择使用其他试验方法。 发育神经毒性评价有单独的试验指南。4在化学品毒性特征的鉴定和评价中，神经毒性是非常重要的一个方面。重复剂量系统毒性试验 指南已经包含了筛选潜在神经毒性的观察指标。使用本试验指南设计的试验，可以获得更多的神经毒 性信息，也可进一步证实在重复剂量系统毒性试验中观察到的神经毒性作用。然而，考虑某些种类化学 品的潜在神经毒性，使用本指南而不是重复剂量试验的指标对化学品进行评价更为合理。考虑的内容 应有：除了重复染毒系统毒性试验，本指南试验可观察到的其他神经症状或神经病理损伤。或与其他已知神经毒物的结构关联或相关的信息。5适用于本试验指南的其他情况，可进一步参考OECD神经毒性策略和方法的指导性文件。6本试验指南能够满足证实化学品特定组织病理学和神经行为毒性的特殊需要，并能对神经毒性 反应做出定性和定量的评价。7过去认为神经毒性即是神经病学，包括神经病理损伤和神经功能障碍，如癫痫、瘫痪或震颤。尽 管神经病变是神经毒性的重要表现形式，但现在逐渐认识到其他一些神经系统毒性的症状如运动协调 障碍、感觉障碍、学习和记忆功能障碍等在神经病学或其他类型试验中无法反映。8本神经毒性试验指南用来检测成年啮齿类动物的主要神经行为和神经病理变化。即使没有形 态学变化，对神经行为的影响依然可以反映出机体的毒性作用，当然并不是所有的行为变化都是神经系 统特异的。因此，所有观察到的变化要结合相关病理学、血液学或生化资料以及其他类型的系统毒性资 料进行评价。本试验指南要求试验能够对神经毒性反应进行定性和定量，包括特定的组织病理学和行 为学上的改变，行为学改变可能需要进一步的电生理和(或)生化检查支持。9神经毒物可能通过多种机制作用于神经系统的多个靶器官。因而，没有一个单独的试验能完全 评价所有化学品潜在的神经毒性，因此，对于某些观察到的或预期的特异的神经毒性可以联合使用其他 的体内或体外试验。10本试验指南可结合OECD神经毒性试验策略和方法的指导性文件设计试验，以便进一步确定 毒性特征或增加剂量反应的灵敏性，从而更好地估算出NOAEL水平或证实化学品已知或可疑的危险 性。如，可以用来确定和评价神经毒性机制或对已有的、通过基本的神经行为和神经病理观察方法得到 的资料进行补充。如果是在本指南推荐的标准试验程序下得到的相关资料并且不需要对结果进行解玎GBT 21787-2008 释，则不必进行重复试验。11神经毒性试验单独使用或与其他试验组合使用，可以提供以下信息：鉴别受试物对神经系统影响是否可逆；对化学品染毒引起的神经系统变化进行定性，了解具体机制；探讨剂量一反应和时间一反应关系，确定NOAEL(可用于确定化学品暴露的安全标准)。12本试验指南适用于经口染毒受试物。其他染毒途径(如经皮或吸人)的受试物也适用，但需要 对推荐方法进行适当修改。对染毒途径的选择要参照人群的暴露情况及可获得的毒理学或毒代动力学 资料。GBT 21787-2008化学品 啮齿类动物神经毒性试验方法1范围 本标准规定了啮齿类动物神经毒性试验的范围、术语和定义、缩略语、试验基本原则、试验方法、试验数据和报告。 本标准适用于检测化学品的神经毒性。2术语和定义、缩略语21术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。211有害作用adverse effect任何与处理因素有关的，引起机体存活、生殖或环境适应能力降低的变化。212剂量dose所受受试物的量，常以质量(g、mg)或动物单位体重所给予的受试物的量(mgkg)：赫；如将受试物掺入饲料进行喂养染毒时，也可以用受试物在饲料中的恒定质量分数(mgkg)来表示。213用量dosage包括染毒剂量、染毒次数及染毒期限在内的一般性术语。214神经毒性neurotoxicity由于暴露于化学、生物学或物理学因素而引起的神经系统结构或功能的有害变化。215神经毒物 neurotoxicant能够引起神经毒性的化学、生物或物理因素。216无可见有害作用的剂量no-observed-adverseeffect level(NOAEL)未发现与染毒有关的有害作用的最高剂量。22缩略语 下列缩略语适用于本标准。 苏木精一伊红染色 H&E(haematoxylin and eosin)3试验基本原则 一定剂量范围的受试物经口对多组啮齿类动物进行染毒。试验通常需要多次染毒，染毒时间可以是28 d，亚急性(90 d)或慢性(1年或更长)。本试验指南的方法也可用于急性神经毒性试验。观察期间对神经毒物引起的行为变化进行评价，对行为和(或)神经系统异常进行检测或定性。试验结束时，对 各组中两种性别的动物分别进行原位灌注固定，对大脑、脊髓和周围神经进行病理组织学检查。单独使用该试验进行神经毒性筛选或对神经毒性作用定性时，不进行原位灌注和组织病理学检查GBT 217872008 的动物可用于进行特定的神经行为、神经病理、神经化学或电生理检查，从而对标准检查项目的资料进行补充。当经验观察或预期结果显示化学品可能具有特定类型或特定靶标的神经毒性时，补充的资料 更为有用。另外，剩余的动物可用于啮齿类动物重复剂量试验的评价。当本试验与其他试验联用时，动物数量要满足所有试验的要求。4试验方法41试验动物和饲养环境411动物种属首选的啮齿类动物是大鼠，其他啮齿类动物如果有充分的证据，也可以使用。选用常用品系的健康 成年动物。雌性动物为未生产过的和未怀孕的动物。动物应该在断奶后立即给药，最好不迟于6周，任 何情况下均不得晚于9周。当本试验与其他试验联用时可做适当调整。试验开始前同一性别动物体重 变化不应超过平均体重的20。如果短期重复染毒试验作为长期毒性试验的预试验，两个试验所用动 物的来源和品系要一致。412动物饲养 动物房温度应为22。C3。C。环境相对湿度通常为5060，除了打扫卫生外，不得低于30或超过70。采用人工照明，12 h明暗交替。低噪音，常规实验动物饲料，不限制饮水。如果受试物是 掺入饲料中染毒，所选的饲料要能与受试物形成合适的混合物。动物单笼或少量同性别动物同笼饲养。413动物数量和性别 健康成年动物随机分成染毒组和对照组。笼具的放置应当使分笼效应降至最低。每只动物应有唯一的编号，适应时间不得少于5 d。如果作为单独的试验进行，处理组和对照组每组至少需要20只动物 (雌雄各10只)用于评价临床症状和功能测试。试验结束时，至少选择10只(雌雄各半)进行原位灌注 和神经病理学检查。如果某组只有有限动物进行神经毒性症状观察，则在有限的动物中选择进行原位 灌注。如果该试验与重复染毒试验联合进行，则动物数量需要满足两个试验的要求。本试验与其他试 验联合进行时每组所需的动物最少数量见表A1。如果需要在试验过程中处死动物、设恢复组用来观 察染毒结束后毒性作用是否可逆、毒性作用的持续时间和是否有迟发性毒性、需要增加额外的数据，在 上述情况下均需要增加动物数量以确保可以进行症状观察和组织病理学检查。42可信度检查 进行本项试验的参考试验室要提供开展本实验的能力和试验操作方法敏感度的资料。这些资料要证明实验室具有检测推荐的各种观察终点(如自主症状、感觉反应、肌力和运动能力)变化并进行定量的 能力。引起不同神经毒性反应类型的阳性物查询有关文献。如果关键的试验步骤一致，则也可以选用 历史资料作为对照。推荐对历史资料定期更新。参考实验室试验的关键步骤有所变化，则要提供新的 试验方法敏感性的资料。43剂量设计剂量的选择要考虑之前观察到的受试物或相关物质的毒性和毒代动力学资料。最高剂量要能诱导 出神经毒性或明显的系统毒性。递减的剂量水平应该能够反映剂量一反应关系；选用NOAEL作为最低 剂量。原则上，选择的剂量应当能够区别神经系统毒性和系统毒性在神经系统的表现。对于递减的剂 量水平，选择的上一剂量最好为下一剂量的2倍3倍，如果选择了四个剂量组，则第三组与第四组的 剂量差别要足够大，(可以超过10倍)。剂量选择还要考虑人群估算的暴露水平。通常至少需要3个染毒组和1个对照组。如果从其他资料推测1 000 mg(kgd)重复染毒可能 不会表现出毒性，则可进行限量试验。如没有资料可供参考，则需在一定的剂量范围进行预试验以确定 最终的染毒剂量。除受试物外，染毒组与处理组应采用相同的处理方式。如果使用了溶剂，对照组应采 用最大体积的溶剂剂量。2GBT 21787-200844样品的配I 必要时可以选用恰当的溶剂，把受试物溶解或悬浮在溶剂中。溶剂首选水，把受试物配成水溶液或悬浮液；其次考虑用油(如玉米油)，配成油溶液或悬浮液，最后选择其他溶剂。溶剂的毒性状况必须是 已知的。另外，还要考虑溶剂以下特点：溶剂对受试物吸收、分布、代谢或贮留的影响，对受试物可能改 变其毒性特性的化学性质的影响，对食物或饮水以及动物营养状况的影响。45染毒本试验指南主要适用于经口染毒受试物，可以通过灌胃法、饮食、饮水或胶囊给药。如果通过其他 途径染毒(如经皮或吸人)，所推荐的试验步骤需做适当修改。动物染毒途径取决于人群暴露状况和可 获得的毒理学或毒代动力学资料。如果对染毒途径以及试验程序进行修改，原因需要注明。试验动物每天染毒1次，每周染毒7 d，至少持续28 d，如进行每周染毒5 d或更短时间，则需要有 充分理由。如果通过灌胃法染毒，应使用灌胃针或其他合适的插管一次给予。液态受试物一次染毒的 最大体积取决于实验动物的大小，应当不超过1 mL100 g。但对于水溶液，最多可达2 mL100 g。除 刺激性和腐蚀性受试物外，其他受试物均应通过调整浓度，使各个剂量组动物染毒体积差别最小。对于 刺激性和腐蚀性受试物，随着浓度的增加，其毒性会急剧增加。如果受试物是掺入食物或饮水中进行染毒，需要确保受试物的量不会干扰正常的营养和水平衡。 如果受试物是掺人食物中染毒，受试物应在食物中保持一个恒定的质量分数(mgkg)或保持一个恒定 的剂量水平，该水平根据动物体重而定；用任何一种方法都必须进行详细说明。对于通过灌胃法染毒的受试物，应该在每天同一时间染毒，并根据动物体重调整，使染毒剂量维持在一恒定水平。如果重复剂 量试验作为长期慢性毒性研究的预试验，则两项研究需使用相同的饮食条件。对于急性毒性试验，如果 选用分次给药，应在24 h完成。46限量试验如使用本指南描述的试验方法，染毒剂量大于l 000 m(kgd)，没有观察到神经毒性作用；并且根 据结构相关化合物的资料分析显示该物质可能没有毒性，则不需进行3个剂量水平的完整试验。不过，预 期人群的暴露水平可能需要使用更高剂量水平染毒进行限量试验。对于其他染毒途径(如经呼吸道或经 皮)，受试物的理化特性决定了最大染毒剂量。急性经口染毒限量试验最小剂量为2 000 mgkg。47试验观察471观察频率重复染毒试验，观察期要覆盖整个染毒期。急性毒性试验染毒后应观察14 d。附加组在染毒后不 再给药，但要观察相同时间。保证足够的观察和检测频率以确保能够检测出所有行为和(或)神经学异 常。考虑到染毒后预期的毒作用有高峰期，每天最好在同一时问观察，临床观察和功能性检测的频率见 附录B。如先前的动力学研究或其他资料表明需要有不同的观察点、测试点或采用不同的染毒观察时 间，则要有另外的时间表确保获取最多的信息。要说明表格修改的原因。472般健康状况和发病率病死率观察 所有动物健康状况至少每天观察一次，死亡率和发病率至少每天观察两次。473临床观察根据不同的试验目的(见附录A)，受试动物在第一次染毒前(考虑到受试动物之间的比较)和染毒 后的不同时间间隔对所选择的动物进行详细的临床观察，时间间隔则取决于试验持续的时间(见 附录B)。附加组的临床观察应持续到恢复期结束。临床观察应在饲养笼外标准的平台上进行。使用具 有测试标准或评分量表的计分系统对所观察到的症状进行详细的记录。检测实验室使用的标准或量表 要定义明确。试验条件的误差尽可能小(非处理因素的系统误差)。经过培训的观察人员通过盲法进行 观察。推荐观察采用有条理的方式进行，每只动物每次观察都有明确定义的标准(包括对正常范围的定 义)。要有充分的记录才能确认是正常范围。要记录所有观察到的症状，并尽可能的对所观察的症状进GBT 21787-2008 行定量分级。临床观察应包括(但不限于)皮肤、皮毛、眼睛、黏膜、分泌物、排泄物等的变化和自主活动(如流泪、竖毛、瞳孔大小、不正常的呼吸模式和(或)用IZl呼吸、不正常的排尿或排便，以及尿颜色的异常)。任何与体位、活动水平(如减少或增加标准活动场所的观察)、运动协调等不正常的反应都要记录。 步态(如蹒跚、共济失调)，姿势(如驼背)和对处理、放置或其他环境刺激产生的反应以及强制运动，抽搐 或震颤，刻板症(如过度理毛、不正常的头部运动、反复转圈)或奇异行为(如嘶咬或过度舔食、自残、倒 退、鸣声)或侵略等行为都要记录。474功能测试与临床观察相同，根据试验目的(见附录A)在染毒之前和之后对受试动物进行功能测试。功能测 试的频率取决于试验的持续时间(见附录B)。除了表B1列出的观察期外，附加组恢复期动物功能测 试尽量安排在接近处死前进行。功能测试包括不同模式刺激(如听觉、视觉和本体感觉刺激)下的感觉 反应性、四肢肌力测定、运动活性测定。运动活性通过自动化装置测定其增加或减少。如使用其他的检 测系统，则该系统必须能够定量且要注明敏感性和可靠性。应确保每个装置在不同时间的可靠性和不 同装置问的一致性。试验程序的具体步骤可参见相关参考文献。若其他资料(如结构一活性，流行病学 资料，其他毒理学资料)表明具有潜在神经毒性作用，要考虑使用更特异的方法检测可能对感觉和运动 活性或学习记忆的影响。有关特定的检测方法及使用的其他信息见神经毒性试验策略和方法的指导性 文件。特别需要指出的是，如果中毒动物表现出的毒性症状干扰了功能测试，则该动物的功能测试结果要 剔除，剔除的原因要说明。475动物体重和食物水消耗对于90 d毒性试验，所有动物至少每周称重1次，食物消耗量(当受试物经饮水染毒时要计算水消 耗量)至少每周测算1次。长期毒性试验，所有动物前13周每周称重1次，之后至少每4周称重1次。 如果动物健康状况或体重变化未出现异常，食物消耗量(当受试物经饮水染毒时要计算水消耗量)前13 周每周测算1次，之后34个月问隔测算i次。476眼科检查对于周期超过28 d的试验，在染毒前和试验结束时，应当用检眼镜或同等适当的仪器对动物进行 眼科检查，最好对所有动物进行检查，至少对高剂量组和对照组。如检查到眼睛的病变或显示的临床症 状需要，则对所有动物都要进行眼科检查。对于长期毒性试验，第13周进行眼科检查。如果其他相同 剂量、类似时间的试验已得到相关眼科检查资料则不需重复。477血液和临床生化 神经毒性试验与重复染毒系统性试验联合进行，则血液学检查和临床生化检查要按照系统性毒性研究的相应的指南进行。样品收集所采用的方法，应当对神经行为的影响最小。478组织病理学检查 神经病理学检查是对体内试验观察的补充和扩展。至少对每组单一性别5只动物进行组织病理检查(见附录A)，采用公认的原位灌注和固定技术进行灌注固定，记录所有观察到的肉眼可见的变化。如 果神经毒性试验单独用于神经毒性筛查或对神经毒性作用进行定性，则剩下的动物可进行特定的神经 行为、神经病理、神经生化或电生理检查，但需补充试验程序和检查结果。剩余动物也可用来增加组织 病理学检查的动物数，如果经验或预期结果表明受试物可能具有一种特定类型或靶标的神经毒性时，这 些补充的试验项目尤为有用。另外，剩下的动物可用于重复染毒的常规病理检查。所有组织样品进行石蜡包埋、常规染色如HE，并用显微镜观察。如果观察到或疑似周围神经病 变，则需要对周围神经组织进行树脂包埋。临床症状也会表明可能需要对额外部位进行检查或使用特 殊染色方法。额外部位的检查见指导性文件。有时可能使用特殊染色法检测特殊病理改变。中枢和周围神经系统代表性切片也要进行组织学检查。检查区域通常包括前脑，大脑中部包括海GBT 21787-2008 马、中脑、小脑、脑桥、延髓、视神经和视网膜的眼球，脊髓颈膨大和腰膨大，背根神经节，背部和腹部的神经根，坐骨神经近端，胫神经近端和胫神经腓肠肌分支处。脊髓和周围神经切片应当包括横切面和纵切 面。特别要注意神经的脉管系统。对骨骼肌特别是腓肠肌样品，也需要进行检查。特别要注意中枢神 经系统(CNS)和PNS易受神经毒剂影响的细胞和纤维结构部位。神经毒物引起的典型神经病理改变的指南查询有关文献。推荐对高剂量组组织样品分步检查，与 对照组进行比较。如没有发现神经病理学变化，则不需要对其他各组进行分析。如高剂量组出现神经 病理变化，则中间剂量组和低剂量组可能受影响的样品也要逐一进行编号、检查。如果在定性检查中发现神经病理变化，则需要对神经系统所有表现这种变化的区域进行进一步检 查。所有试验组可能受影响的区域的样品要进行编码并采用盲法随机检查。所有损伤发生的频率和严 重程度都要记录。对所有试验组病检区域进行分级，然后打乱编码，对剂量一反应关系进行统计学分析。 对不同损伤的严重程度进行描述。神经行为学观察和测定资料结合其他已有或同时进行的受试物系统毒理学试验资料，对神经病理 学观察结果进行评价。5试验数据和报告51试验数据 应当提供单只动物的资料。另外，应当以表格形式总结出以下资料：试验开始前每个试验组和对照组动物数、试验过程中死亡动物数及人道处死动物数以及死亡和人道处死时间、出现中毒症状动物数、 观察到的中毒症状的描述(包括所有中毒症状开始的时间、持续的时间、类型和严重程度)、出现损伤的 动物数(包括损伤的类型和严重程度)。试验结果要根据发生率，严重程度以及与神经行为和神经病理(神经生化或电生理以及其他补充的 资料)改变的相关性和观察到的其他毒性作用进行综合的评价。选用恰当公认的统计方法对资料进行 统计分析。统计方法应当在试验设计时确定。52试验报告 试验报告应包括以下资料：521受试物a)物理性质(包括同分异构、纯度和理化特性)；b)名称和识别码。522溶剂选择溶剂的原因。523动物 a)动物种属、品系； b)动物数量、年龄和性别； c)来源、饲养条件、适应期、饲料等；d)试验开始前每只动物的体重。524试验条件 a)受试物制剂饲料制备的详细资料、浓度、稳定性和均一性； b)染毒剂量说明，包括溶剂的详细资料，使用体积和染毒物的物理形态； c)受试物染毒的详细资料；d)剂量水平选择的理由；e)染毒途径和染毒持续时间选择的理由； D受试物掺人饮食水浓度换算成实际剂量Emg(kgd)； g)饲料和饮水质量的详细资料。5GBT 21787-2008525试验观察和测试步骤a) 每组动物进行灌注分组的详细资料；b)评分系统的详细资料，包括每个临床观察测试指标的标准和评分量表；c)对不同模式刺激(如听觉、视觉和本体感觉)的感觉反应性功能测试；四肢肌力测定，运动活性 (包括检测活性的自动化装置)测定以及使用的其他方法；d) 眼科检查的详细资料、血液学检查和临床生化检查及其基准值的详细资料；e)特定神经行为、神经病理、神经生化或电生理方法的详细资料。526试验结果 a)动物体重体重变化，包括处死时动物体重； b)饲料消耗和水消耗量(如果需要)； c)不同性别和剂量水平的毒性反应资