一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究.doc

蚌埠学院本科毕业设计（论文）一株纤维素酶产生菌的鉴定及酶学性质研究1 引 言1.1 研究纤维素酶的作用和意义 纤维素是植物纤维的主要成分，也是地球上最丰富的可再生有机资源。据报道，全世界每年通过光合作用产生的纤维素，其中有89%尚未被人类利用，我国每年仅农业生产中形成的农作物残渣(稻草、秸秆等)就约有7亿t，如何有效利用这些资源已经成为近年来研究的热点。纤维素占植物干重的35%-50%，是地球上分布最广的碳水化合物，同时又是自然界数量最大的可再生资源。纤维素废弃物的有效利用和生物转化已成为世界上许多国家关注的重要科研领域之一。要使纤维素酶真正能够用于工业生产，首先要降低纤维素酶的生产成本。因此，选育高酶活的纤维素分解菌株就成了解决问题的关键之一。1.2 牛胃消化纤维素 图1-1 图1-2瘤胃微生物(rumen rnicrobes)是指栖息在瘤胃中的微生物。瘤胃是反刍动物降解纤维素的消化器官，纤维素的降解靠瘤胃微生物分泌的纤维素分解酶，瘤胃内含有复杂的微生物区系，不同的微生物对纤维素和其它营养物质的消化各显功能，并有互补作用。纤维素的消化是纤维素酶水解的结果，纤维素酶是多组分复合酶，主要为内切型葡聚糖酶，外切型葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶。瘤胃微生物通过合成和分泌-1，4-纤维素分解酶复合物，确保了对植物细胞壁的水解，调控瘤胃内环境促进微生物分泌消化酶，或者向饲料中添加酶制剂，都有利于饲料纤维素的利用 。瘤胃微生物能分泌纤维素酶，因此瘤胃有较强的发酵和分解纤维素的作用。在瘤胃微生物中，对纤维素降解起主要作用的还是瘤胃细菌。本文主要从牛胃液中分离出兼性氧的高产纤维素酶细菌，对分离所得菌株进行初步鉴定及并对其发酵产纤维素酶的酶学性质进行初步探讨，从而为最终得到产纤维素酶，性能优良的微生物菌株。2 菌种的鉴定2.1 材料与方法2.1.1实验的菌种 实验用的菌种由齐肇然同学提供的产纤维素酶枯草芽孢杆菌属的Q菌种。2.1.2 培养基固体培养基：蛋白胨5.0g，(NH4)2S04 1.0g，羧甲基纤维素钠 CMCNa 10.0g，NaCl3.0g，KH2PO4 2.0g，MgSO47H2O 1.0g，FeSO47H20 10.0mg、MnSO4H20 5.0mg，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL，调pH值6.7。发酵培养基：蛋白胨2.0g，酵母膏1.0g，(NH4)2SO4 2.0g，CMC-Na 20.0g，NaC1 3.0g，KH2PO4 2.0 g，MgSO47H20 1.0g，FeSO47H2O 10.0 mg MnSO4H2O 5.0mg，调pH值6.7。Q菌的硫化氢培养基：蛋白胨10.0g ，牛肉膏10.0g ，酵母膏5.0g ，柠檬酸氢二铵（NH4）2HC6H5O7 2.0g，葡萄糖(C6H12O6H2O) 20.0g，乙酸钠（CH3COONa3H2O）5.0g ，磷酸氢二钾（K2HPO43H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO47H2O）0.58g ，硫酸锰（MnSO4H2O）0.25g，琼脂 18.0g、蒸馏水1000mL，pH6.26.6。Q菌的硝酸盐培养基：硝酸盐培养基，硝酸盐培养基成分为硝酸钾0.2g蛋白5g，蒸馏水1000mL，pH 7.4。试剂：甲液（对氨基苯磺酸0.8g 5moL/L醋酸lOOml；乙液（-奈胺0.5g+5moL/L醋酸lOOmL）。Q菌的酚红肉汤基础培养基：肉汤培养基的碳源为甘油，称之为甘油肉汤培养基，胨 20g，甘油 10mL，氯化镁(无水) 1.4g，琼脂14g，硫酸钾(无水) 10g， 水 1000mL取胨，氯化镁和硫酸钾加入水中，微温溶解，调节pH使灭菌后为7.30.1，加入甘油和琼脂，加热溶化，混匀，分装于试管，灭菌，制成斜面。2.1.3 实验的主要试剂及仪器 试剂：香柏油，二甲苯，3%过氧化氢溶液，锌粉，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露糖，半乳糖，乳糖，麦芽糖。硝基水杨酸试剂(DNS)，1%CMC-NA溶液，蛋白胨，牛肉膏，尿素，硫酸铵，硝酸钠，0.05 mol/L柠檬酸缓冲液等。 仪器：显微镜，染色片，酒精灯，接种针，DHP-9272型电热恒温培养箱；UV-2000分光光度计；pHS-25型pH 计；电热恒温水浴锅；高速离心机；恒温摇床等。2.2 形态学观察2.2.1实验的内容用显微镜观察Q菌染色装片。2.2.2 实验材料和用具 Q菌的染色装片，香柏油，二甲苯，显微镜，擦镜纸。2.2.3 操作步骤将显微镜的置于平稳的实验台上，调节好光源；上升镜筒，将Q菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈，然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升至发现物象时，改用细调节器调节到物象清楚为止。移动装片，把合适的观察部分移至视野中心；眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与破片相撞。再用目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部分移至视野中心。不要移动装片位置，准备用油镜观察；提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位滴香柏油。从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中有物象出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降至未到位或镜头上升太快未找到物象，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。2.2.4 实验观察的结果Q菌落：呈直径3-7mm圆形，中央略凹陷；菌落呈白色，有光泽，菌落突起，边缘平整；部分有芽孢，芽孢呈椭圆。2.3 生理生化鉴定2.3.1 Q菌的革兰氏染色革兰氏染色法：将Q菌株初染，酶染、脱色，复染等四个步骤，具体操作方法是： 将Q菌的涂片固定；草酸铵结晶紫染1分钟；自来水冲洗；加碘液覆盖涂面染3分钟；水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。蕃红梁色液（稀）染10秒钟后，自来水冲洗；干燥，镜检。 染色的结果:Q菌体呈紫色。说明Q菌是革兰氏阳性菌。2.3.2 Q菌的硫化氢试验及其运动性的判断(1)菌种：Q菌的硫化氢培养基,内含蛋白质与硫代硫酸钠作为硫受质的培养基，另含硫酸铵亚铁作为硫化氢指示剂。(2)器材：酒精灯，接种针 (3)实验步骤 无菌操作将Q菌分别穿刺接种至培养基中。将所有试管置于35下培养24-48小时。 (4)结果分析：检视培养基，观察接种线有黑色产生。依观察所见，判断Q菌是具有产生硫化氢之能力。 观察Q菌，没有沿接种线向四周扩散，并判断其不具有运动性。2.3.3 Q菌的触酶试验(1)原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。 (2)试剂：3%过氧化氢溶液。 (3)方法：直接滴加3%过氧化氢的H细菌培养物中，立即观察结果。 (4)结果：不产生气泡，证明Q菌为阴性。 23.4 Q菌明胶水解试验(1)方法：挑取1824h Q菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于3436培养714天。明胶高层亦可培养于361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动，静置冰箱中待其凝固后，再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，1020min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。(2)结果：Q菌未被液化，在菌落上滴加明胶试剂，1020min后，菌落周围没出现清晰带环。证明Q菌的水胶试验为阴性。2.3.5 Q菌硝酸盐还原试验(1)原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其他还原性产物。但硝酸盐还原的过程因细菌不同而异，有的细菌仅使硝酸盐还原为亚硝酸盐，如大肠埃希菌；有的细菌则可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；有的细菌能使硝酸盐或亚硝酸盐还原为氮，如假单胞菌等。硝酸盐还原试验系测定还原过程中所产生的亚硝酸。(2)Q菌的硝酸盐培养基(3)步骤：将Q菌接种于硝酸盐培养基中，于35培养2d。将甲液和乙液等量混合后（约0.1mL）加入培养基内，立即观察现象。(4)试验现象：无颜色变化；加入少许锌粉后，出现红色。(5)试验结果分析：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。表2-1 H细菌的生化反应结果项目H菌硫化氢试验阳性触酶试验阴性明胶水解试验阴性硝酸盐还原试验阴性运动性阴性2.3.6 Q细菌的糖或醇发酵实验的结果(1)原理：不同种类细菌含有发酵不同糖,醇类的酶，因而对各种糖，醇的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖，醇，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖，醇降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。糖，醇发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖，醇，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸，产气，故可利用此试验鉴别细菌。(2)方法：在酚红肉汤基础培养基pH 7.4加入0.51.0%（w/v）的特定糖，醇或苷类。所使用的糖，醇或苷类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等。将待鉴定的Q细菌接种入试验培养基中，置35恒温箱内30h后，观察结果。(3)结果：能分解糖，醇或苷产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。表 2-2 H菌的糖或醇发酵实验的结果项目H菌葡萄糖阴性果糖阴性山梨醇阴性甘露糖阴性半乳糖阴性乳糖阴性麦芽糖阴性3 H菌酶学性质的研究3.1 最适生长条件3.1.1 最适的生长温度将菌株直接从斜面转接到筛选平板上，采用四点种植法，分别于20，25，30，35，40，43，48下培养48h。观察到Q菌能在20至48生长，从表中是实验结果可以看出，该菌的最适温度是35左右。表 3-1 不同温度下细菌的水解圈大小温度/20253035404348水解圈平均直径/mm123632.503.1.2 最适生长 pH值 将菌株直接从斜面接到pH值分别为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，l2.0的筛选平板上，在37下恒温培养2d。实验结果如表3-2所列。实验结果表明，该菌在pH 3.0和pH 120下不生长；在 pH 4.0，5.0，l1.0，10.0生长缓慢；在pH 6.0，7.0，8.0生长良好。表 3-2 不同pH值下H菌株的菌落生长情况PH值3.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0长 24h势 48h+注：表中长势的“”代表不生长；“+ ”表示长势微弱；“+”表示长势般；“+”表示长势良好；“+”表示生长很好； “+”表示生长极好。3.1.3 对02的需求 通过穿刺培养观察到，该菌株在穿刺培养基表面，比在培养基深处生长旺盛，表明该菌株为兼性厌氧菌。3.2 菌株产酶条件的研究 3.2.1接种量对产酶的影响选择合适的接种量，对微生物产酶有一定的影响,本试验分别用 1%，2%，3%，4%，5%的接种量进行产酶试验，35，200r/min摇床培养40h，检测发酵液CMC酶活力。酶活力单位：将每小时由底物形成 1.0 mg还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，以U/mL表示。CMC酶活的测定。每个菌株取4mL发酵液，6000r/min离心10min，取上清液则为粗酶液。在25mL刻度试管中先加入1.5mL 1%CMC-NA溶液，再加入0.5mL粗酶液，摇匀灭活对照，在25mL刻度试管中加入1mL l%CMC-Na溶液再加入0.5mL灭活的粗酶液(将粗酶液在沸水浴中加热5min制得)，摇匀。样品与灭活对照同时放入(501) 水浴中保温反应1h后，立即加入3ml DNS试剂。之后将各样品及空白对照同时放入沸水浴中反应5min，取出后立即置于冰水中冷却至室温。表 3-3 H菌接种量与CMC酶活的关系接种量1%2%3%4%5%CMC酶活/U7.645.044.834.925.23结果表明，接种量在 1%2%之间对产酶比较合适，3%5%之间基本上变化不大，相对1%2%的接种量而言，酶活稍有降低。综合考虑，接种对发酵液中纤维素酶活力的影响在后续的发酵中均以1.5%的接种量进行接种发酵。3.2.2氮源对Q菌株产酶的影响 分别采用蛋白胨，牛肉膏，尿素，硫酸铵，硝酸钠五种不同的氮源，研究不同氮源对H菌株产酶的影响，总氮为1%。以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，35，200r/min下摇床培养40h。表3-4 Q菌CMC酶活性与氮源的关系氮源蛋白胨牛肉膏尿素硫酸铵硝酸钠CMC发酵酶活性/U ml-115.9825.124.534.444.26从表可以看出有机氮源，能提高发酵液中纤维素酶活力。牛肉膏的效果最好，另外三种无机氮源效果相差不大。3.2.3碳源对Q产酶菌的影响采用3种天然碳源，浓度为30g/L的玉米秸粉、木屑、纤维素粉作为碳源物质(纤维性材料)，碳源对纤维素酶各组分的影响见表3-5。滤纸酶活(FPA)的测定方法：滤纸酶活法是国内外广泛采用的一种测定纤维素酶总活力的方法。取4支20 mL具有刻度的试管，加入1.5 mL, pH=4.5, 0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，1号试管作为空白对照。2，3，4号试管中加入0.5 mL上述粗酶液。4支试管同时在5O水浴中预热，5min后将新华1号滤纸(1cmx 6cm)卷成小卷放进试管内，5O保温1h后取出，各试管迅速加入1.5 mLDNS试剂以终止酶反应，并向1号管中补加0.5mL酶液。将各试管充分摇匀后在沸水浴中加热5min，取出冷却后用水定容至25 mL。以1号管溶液为空白对照，在540 nm波长下测定吸光度。上述3支试管吸光度的平均值为该样品的吸光度表3-5 不同碳源对产酶的影响碳源FPA酶活/UmL-1CMC酶活/UmL-1玉米秸粉3.798.61木屑1.956.64纤维素粉4.329.80当用纤维素粉作为碳源进行发酵培养时，纤维素酶活力最高。两种酶活的顺序与碳源有关，纤维素粉玉米秸粉木屑，这可能与纤维素粉对纤维素酶的诱导能力更强有关，因纤维素粉为纯纤维类物质。而当以木屑为碳源，两种酶活都最低，可能是因为在这几种碳源中木屑中的木质素含量最高，对纤维素原束起一种物理包埋作用，阻碍了酶对纤维素的水解，使菌体不能利用它们生长产酶。3.2.4装液量对Q产酶菌的影响装液量对产酶的影响见表3-6。由表3-6可知，在250 mL三角瓶中，装液量在50-75 mL时菌种的产酶能力比较大，而当装液量达100 mL时，酶活力下降显著。 表3-6 不同装液量对Q产酶菌的影响装液量mL5075100125FPA酶活/ Uml-122.1326.5315.6712.14CMC酶活 /Uml-144.2645.0535.6320.633.2.5不同的发酵时间对Q产酶菌的影响表3-7 不同发酵时间对Q菌的影响培养时间/H102030405060FPA酶活/Uml-12.235.0511.65.435.345.32CMC酶活/Uml-15.4510.2320.516.5210.036.57将Q菌株在摇瓶条件下进行产酶试验，每隔10h进行FPA酶和CMC酶的测定。从 可以看出，Q菌株培养液的FPA和CMC酶活在10h后产酶能力逐渐提高，FPA酶在前30 h内一直提高，在30h之后逐渐下降；CMC酶活在前25h逐渐上升，30h后逐渐下降。3.2.6 起始PH对Q菌产酶的影响 表3-8 起始PH对Q菌产酶的影响起始的PH56789FPA的酶活/Uml-120.1522.344.4562.2360.23该菌在发酵液起始pH为8时，产酶活最高。pH低于或高于8，其酶活均下降，但高于8时下降较慢，说明该菌株在碱性条件产酶高4 实验的结果分析及讨论从牛胃液中筛选到一株产纤维素芽孢杆菌属的菌株，革兰氏染色呈阳性，兼性厌氧，其最适生长pH值为6.08.0，最适生长温度为35左右。经产酶动力学初步研究表明，所筛选到的Q菌株在35下，适当的培养条件下培养至30h，发酵液中的纤维素酶的活性达到最高值。本文通过对细菌菌体及菌落的形态、大小、颜色的形态学观察以及细菌其它特性和生化结果的测定，来判定细菌的种属。按照1986版的伯杰细菌鉴定手册(5)和伯杰细菌鉴定手册第八版所示的芽孢杆菌属的特征及特性。初步鉴定实验菌Q菌为一株芽孢杆菌属的产纤维素的菌。结 论 与 展 望从牛胃液中筛选到一株产纤维素的芽孢杆菌属的Q菌，革兰氏染色呈阳性，兼性厌氧，其最适生长pH值为6.08.0最适生长温度为35左右。经产酶动力学初步研究表明，所筛选到的Q菌株在35下，适当的培养条件下培养至30h，发酵液中的纤维素酶的活性达到最高值。试验证明，Q菌株具有优良的产纤维素酶的性能。本实验尚未对其他发酵条件进行优化，如能对发酵条件进行进一步优化，相信该菌株的产纤维素酶的能力会得到相应的提高。纤维素是自然界中最丰富的可再生自然资源，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸杆的产量达到5.7xlOt，约相当于我国北方草原年打草量的50倍。目前这部分资源尚未得到充分的开发和利用。瘤胃纤维分解菌可分泌纤维素酶来有效的降解纤维素。因此瘤胃纤维分解菌的研究具有极其重大的现实意义和光明的发展前景。谢 辞本论文是在指导老师王永斌教授悉心指导下完成的，从论文的选题、实施到完成以及论的审阅，导师倾注了大量的心血。导师渊博的学识，严紧的治学态度，勤奋忘我的工作作风，开阔的科研思路和诲人不倦的师者风范，使我不仅在学术上还是在人生态度上将终生受益。值此论文完成之际，向导师致以最诚挚的敬意和最衷心的感谢。在论文开题论证以及整个论文试验期间，同学齐肇然，张瑞，王勇在整个实验中都给予了很大的帮助，在此谨向以上各位表示最诚挚的感谢。最后，向所有关心我的各位老师、同学、亲戚和朋友们表示衷心的感谢！ 作者：杨震宇 2009.6.10参 考 文 献1 邱雁临纤维素酶的研究与应用前景J.粮食与饲料工业.2001(8)：30-31 .2 宋颖琦，刘睿倩,杨谦等纤维素降解菌的筛选及其降解特性的研究J哈尔滨工业大学学报，2002，34(2)：197-200 .3 蓝贤勇,陈宏,张润锋等瘤胃微生物纤维素酶的研究与应用前景J2003(2)：36-39 .4 沈雪亮，夏黎明产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究J林产化学与工业，2002(3)：47-51 .5 韩韫，蔡俊鹏纤维素酶海洋菌株的筛选及鉴定J现代食品科技，2005，21(3)：36-38. 6 诸葛健，王正祥工业微生物实验技术手册北京：中国轻工业出版社，1997 7 刘洁，李宪臻，高培基纤维素酶活力测定方法评述J工业微生物，1994，4：27-32 .8 Ghose TKMeasurement of cellulase activityJPure and App1Chem，1987，59(2)：257-268.9 蔡燕飞,李华兴纤维素分解菌的筛选及鉴定IJJ林产化学与工业 200525(2)：67-70. 10 Hobson P N Rumen bacteria，In J RNorris et al Ribbons(td Methods in mierobiohgy，vo).3B.Aeademic Press,Inn(LondonLtd，l,ondon1969：133-149 .11 R.E.布坎南，NE吉本斯 伯吉细菌鉴定手4RM1科学技术出版社 1981：725-727. 12 东秀珠，蔡妙英，等常见细菌系统鉴定手册M J科 学出版社200：370-399.13王晓芳，徐旭，吴敏，等一株纤维素分解菌的分离与筛选J生物技术， 1,1(2)：2730附 录一1株产纤维素酶真菌的鉴定及其酶学性质初探朱建良，邱晔平，陈晓晔，杨晓瑞(南京工业大学制药与生命科学学院，江苏南京210009)摘要 目的对筛选得到的l株产纤维素酶的优良菌株进行鉴定，并研究其酶学性质。方法利用传统分类学方法、电子显微镜观察、18SrDNA和序列的测定以及系统发育分析对l株分离自腐败水葫芦中产纤维素酶真菌DI进行分类鉴定 ，并对其产酶性能进行了初步研究。结果各种指标鉴定表明其为青霉属真菌斜卧青霉(Penicillium decumbens)。该菌株经发酵培养120 h，产酶酶活达到最高；活性在