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食品微生物快速检验方法的研究进展-学院生命科学与技术系，- 529566摘要： 微生物是影响食品安全最重要的因素之一，科学家们一直在寻在快速检测微生物的方法。近年来,随着生物技术的快速发展,新技术新方法在食品微生物检验领域得到了广泛应用,有效的提高了检测效率和检验速度。本文主要介绍生物化学技术、免疫检测技术、快速测试片法、细菌直接计数法和基因芯片技术。关键词：食品微生物；快速检测方法一、前言随着人们生活水平的不断提高,食品安全问题越来越受到人们的重视,微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染,微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质,或导致食源性感染和食物中毒。1 生物化学技术1.1PCR技术 PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。1.2基因探针技术 基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNARNA或DNADNA链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的GENPROBE基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验1，基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。2 免疫检测技术2.1 免疫检测技术的基本原理2 免疫学是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础。抗原是指能够刺激动物体的免疫系统发生免疫应答，产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内或体外与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。作为抗原物质应具备的特点是异物性、高分子量和分子结构的复杂性。食品或食物中的许多大分子(包括蛋白质、酶、多糖、核酸及感染微生物等)都是良好的抗原，而一些小分子物质( 如激素、真菌毒素或农药残留物)可以通过与大分子载体(一般为蛋白质) 相结合制备成人工抗原。因此，从理论上看，食品科学中遇到的几乎一切物质都可直接或间接地作为抗原。抗体则是抗原引起的免疫应答的产物之一，可与引发的抗原发生特异性结合反应，据此可进行精确的定性定量的分析测定。2.2 在食品检验中应用的主要免疫检测技术（1）酶联免疫分析法(ELISA)3 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，其基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时，将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。国内在这个方面的研究工作开展得相对较晚，但也取得了一些进展。（2）单克隆抗体检测技术 利用细胞培养和细胞融合技术制备出具有抗原特异性单一的抗体(单克隆抗体)，性能稳定，可辨认抗原物质结构的微细差异，并和抗原发生特异性结合，避免其它分子的干扰，能精确地测定抗原物质的含量。免疫学方法中的特异性抗体多采用多克隆抗体而单克隆抗体的报道不多，用于食品检测的更少。但单克隆抗体重复性好，特异性强，不容易发生交叉反应，其特异性已经引起各国学者的重视。（3）其他免疫检测方法 早期的放射免疫分析法(RIA)，由于使用放射性标记物和缺少改进空间，现在已经使用得很少。近年来，用其他免疫方法对食品进行检测也有一些成功的报道，如免疫磁珠富集技术；利用单克隆抗体胶体金法(MOP)检测也有成功的例子4，该方法采用高度特异性的抗原、抗体反应及免疫色谱分析技术，不需要对样品进行前处理。3 快速测试片法快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体,将特定的培养基和显色物质附着在上面,通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法5。这是一种集化学、高分子学和微生物学于一体的检测方法。采用快速测试片检测具有显著的优点：第一,快速测试片可测定少量检品,不需要配制试剂,不需要大量的玻璃器皿,操作简便迅速;易于消毒保存,便于运输,携带方便,价格低廉,加之除纸片外无其他任何废液废物,大大减少或消除对环境的污染,以及试验后的清洗工作,减少了工作量。另外,避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷,故适用于实验室、生产现场和野外环境工作使用。第二,快速测试片可以在取样时同时接种,结果更能反映当时样本中真实的细菌数,防止延长接种时间时由于细菌繁殖造成的数量增多。第三, 常规法一般需要时间较长,而且要特定的温度,这样导致许多基层单位和食品企业不能实施,也不能达到及时检测的目的。而测试片无需进行使用前的准备工作,大大缩短了时间。4 细菌直接计数法主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量鉴定6。目前已经建立了细菌总数7、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌等：的FCM检验方法。固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测8。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到ChemScan上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于生长缓慢的微生物检测用时短，使该方法明显优于传统平板计数法9。此方法要求配备特殊的仪器，财政投入较大，因此基层单位目前暂时无法应用。5 基因芯片法 基因芯片技术是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA 经PCR 扩增后制备荧光标记探针，再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量并分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。基因芯片技术可以对环境中的微生物实现高通量和并行检测。它在理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病原可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标；同时具有灵敏、特异和快速便捷等优点：因而在致病微生物检测中有很好的发展前景。Borucki等；如1 构建的混合基因组微阵列可准确鉴别各种近缘单核增多李斯特菌分离物：Vol0kh ov通过单管复合体扩增和基因芯片技术检测和鉴别6 种李斯特菌：Call等：通过分析Ecoli0157：H 7的Sh ig a 样毒素I、Sh ig a 样毒素及溶血素A，发现基因芯片可准确检测各种Ecoli 0157：H 7分离物。目前虽然在样品采集、处理以及基因芯片技术等方面取得了很大的进展。然而要更广泛地应用基因芯片技术检测食品微生物，还需解决诸如建立标准化程序、降低检测费用、简化样品制备和标记操作、进一步提高检测的特异性等一系列问题。参考文献1 时炜产单核细胞李氏菌在食品中的研究近况J中国卫生检验杂志，2003，13(1)：122.2 李军生，叶云等.免疫检测技术在食品检验中的应用J.广西工学院学报. 2003,16（1）:23- 26.3 王兰兰临床免疫学和免疫检验M北京：人民卫生出版社，20039 1- 9 3.4 4 熊剑娟，王盛良.胶体金免疫试纸法快速测定调味汤料中罂粟生物碱J.中国卫生监督杂志，2002，(6)：3545 5 李洪,龚涛,达永淑,等.探讨影响大肠菌群快速纸片法的因素J.职业卫生与病伤, 2002, 17 (3): 19 8 19 9 1.6 Gunasekera TS,Veal DA，Attfield PVPotential for broad applications of flow cytometry and fluorescence techniques in microbiological and somatic cell analyses of milkJInt J Food Microbiol，2003，85(3)：269-2797 Gunasekera TS,Attfield PV,Veal DA.A flow cytometry method for rapid detection and enumeration of total bacteria in milkJAppl Environ Microbiol，2000，66(3)：1228-12328 Lisle JT,Hamilton MA，Willse AR，et alC