蛋白质研究原理与技术

第六讲蛋白质研究的原理与技术PrinciplesandTechniquesofProteinAnalysis 34204192生物药学楼2 203室 一 蛋白质分离与纯化技术二 蛋白质的性质与功能研究技术三 蛋白质的相互作用研究技术 蛋白质纯化与鉴定实验指南 朱厚础等译 2000 科学出版社TheRecombinantProteinHandbook ProteinAmplificationandSimplePurification 18 1142 75ProteinPurification Handbook 18 1132 29 References 一 蛋白质分离与纯化技术TechniquesinProteinExtractionandPurification 蛋白分离纯化的目的与意义 获取纯蛋白 提高蛋白生化性能 蛋白质修饰与蛋白结晶的前提 获取高纯度蛋白 去除杂蛋白 抗原性 是蛋白药物使用的前提 蛋白纯化在蛋白制备中所占费用最大 常达到90 蛋白质纯化总原则 GeneralPrinciple 以合理的效率 Efficiency 速度 Speed 收率 Yield 和纯度 Purity 将目标蛋白从细胞的全部其他成分特别是杂蛋白中分离出来 并保留其生物学活性和化学完整性 浓度纯度活性 蛋白质纯化通用步骤 一 蛋白纯化方法概述 二 常用层析技术介绍 三 常用电泳技术介绍 基础 不同蛋白质理化性质的差异原因 氨基酸的组成与数目不同与蛋白纯化相关的理化性质分子大小分子形状带电特性溶解特性与配体特异性结合不同吸附性质变性和复性 一 蛋白纯化方法概述 1 分子大小 大小 主要取决于蛋白质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数目 几百 百万Da常用方法透析 Dialysis 超滤 Ultrafiltration 凝胶过滤 Gelfiltrationchromatography 超速离心 Ultracentrifugation 透析 超滤 凝胶过滤 超速离心 2 分子形状 形状形状的不同会影响蛋白质在离心通过溶液时 或通过膜 凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动的速度 方法密度梯度离心 Densitygradientcentrifugation 蛋白电泳 SDS polyacrylamidegelelectrophoresis SDS PAGE 密度梯度离心 SDS PAGE 3 电荷 电荷蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正 负电荷总和 酸性蛋白质 天冬氨酸和谷氨酸占优势 pH7 0时带负电荷碱性蛋白质 赖氨酸和精氨酸占优势 pH7 0时带正电荷方法等电聚焦电泳 IsoelectricFocusing IEF 双向凝胶电泳 Two dimensionalelectrophoresis Two DE 离子交换层析 IonExchangeChromatography IEC 等电聚焦 双向凝胶电泳 离子交换层析 4 溶解度 原理蛋白质分子表面的亲水性和疏水性带电基团差异导致其在溶剂中的溶解度不同 方法 通过改变pH 离子强度或加入有机试剂 促进蛋白质分子的凝聚进而形成沉淀 沉淀法盐析法 Saltprecipitation 有机溶剂沉淀法等电点沉淀法 盐析 高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水 破坏蛋白质分子表面的水膜 同时盐离子也会影响蛋白质分子所带电荷 引起蛋白质沉淀 但通常不会引起蛋白质的变性 硫酸铵分级沉淀 有机溶剂分级沉淀 等电点沉淀法 5 配体特异性结合 原理生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合 这种结合是特异的又是可逆的 生物分子间的这种结合能力称为亲和力 方法将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上 利用分子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化 分类 亲和层析 Affinitychromatography AC 免疫亲和层析 Immunoaffinitychromatography IAFC 生物亲和层析金属螯合亲和层析 免疫亲和层析 6 吸附性质 方法疏水层析 HydrophobicInteractionChromatography HIC 基础 蛋白质的疏水性差异利用固定相上偶联的疏水性配基与流动相中的疏水分子发生可逆性结合而进行分离 反相层析 Reversedphasechromatography 基础 蛋白质的极性差异流动相的极性大于固定相的层析技术 蛋白分子在该系统中的移动速度依其极性排列 极性大者移动快 疏水层析 7 变性和复性 原理蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间结构 生物学功能及部分理化特性等称为变性 当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物学功能即为复性 方法包涵体蛋白的变性纯化与复性 通用性 独特性 程序化 二 常用层析技术介绍 凝胶过滤层析 Gelfiltration 分子筛层析 离子交换层析 Ionexchange 疏水作用层析 Hydrophobicinteraction 亲和层析 Affinity 1 基本原理 待分离蛋白质溶液 流动相 经过一个固态物质 固定相 时 根据溶液中待分离的蛋白质大小 电荷及亲和力等 使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配 并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 基本原理图 2 装置 蠕动泵层析柱检测器记录仪分部收集器紫外检测仪蛋白电泳系统 超声波破碎仪 层析柱 分部收集器 Howtoobtaintherecombinantproteins 3 亲和层析 原理亲和层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结合的特性而分离蛋白质的一种层析方法 将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上 当混合样品流过此支持物时 只有目标蛋白能与配体专一性结合 而其他杂蛋白不能结合 先用结合缓冲液洗脱杂蛋白 然后改变洗脱条件 将目标蛋白洗脱下来 原理图 重组蛋白制备SDS PAGE图谱 亲和标签 His6 6个连续组氨酸GST 谷胱甘肽转移酶CBD 几丁质结合结构域 ChitinBindingDomain MBP 麦芽糖结合蛋白 MaltoseBindingProtein Biotinatedpeptide 生物素化多肽链FLAG DYKDDDDK Stag T7tag T7StepTagII 生物素功能类似物 亲和标签选择因素 亲和标签是否会影响目标蛋白的结构和功能 小 蛋白质的稳定性亲和标签所融合的位置 N端 C端 是否需在变性条件下进行亲和纯化 标签适合否 亲和标签对表达水平的影响 标签 蛋白 系统 是否需标签具有鉴定功能亲和洗脱的条件 不使蛋白变性 亲和介质和缓冲液的费用是否在亲和纯化后去除标签 3 1His6 Ni亲合层析 金属螯合层析 原理 基于蛋白质表面的一些特定的氨基酸残基侧链 尤其是组氨酸 在中性和弱碱性条件下可以和固定化的金属离子相互作用 如Ni2 Zn2 和Co2 从而分离蛋白质 His标签是目前应用最为广泛的亲和标签 His标签优缺点 优点 标签分子量小 一般不影响目标蛋白的功能 可用于变性 非变性纯化 可用于蛋白质 蛋白质 蛋白质 DNA互作研究 免疫原性较低 可直接用于抗体制备 可应用于多种表达系统 纯化条件温和 可和其它亲和标签共同构建双亲和标签 缺点 融合蛋白易形成包涵体 包涵体蛋白难于溶解 融合蛋白溶解后不能正确复性 层析时螯和的金属离子容易泄漏 非特异性结合会造成制品纯度不高 3 2谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签 GST 最早使用的亲和标签 目标蛋白加于GST的C端 再利用谷胱甘肽亲和介质进行纯化 或固定在亲和介质上进行蛋白质 蛋白质互作研究 因GST分子量较大 且以二聚体的形式存在 一般都需要去除融合标签 此系统必须依赖于GST的正确折叠 GST融合蛋白常用来免疫动物生产抗体 及作为载体蛋白进行蛋白结晶 3 3几丁质结合肽 NEBIMPACT系统以几丁质结合肽为融合标签 融合蛋白可用几丁质亲和层析纯化 利用内含肽 intein 特异性原位剪切直接获得目标蛋白 最大优点 不需使用蛋白酶来去除融合标签 包括以下几类 巯基诱导的N端剪切系统 巯基诱导的C端剪切系统 pH诱导的C端剪切系统 可用于蛋白质环化的双内含肽系统 基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化 3 4麦芽糖结合蛋白 MBP 此系统使用交联直链淀粉的亲和介质纯化 用麦芽糖进行竞争性洗脱 优点 MBP无半胱氨酸残基 不干扰目标蛋白形成正确二硫键 使用的介质价格低廉 可在温和条件下洗脱融合蛋白 加上其分泌信号 可以进行分泌表达在细胞周质 这一系统最显著的特点是可改善目标蛋白的溶解性 促进正确折叠 提高活性蛋白的回收率 MBP标签亲合纯化 3 5与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签 生物素 抗生物素蛋白 Avidin Biotin 是目前最强的亲和作用之一 StrepTag系统是通过筛选噬菌体随机肽库得到的短肽 含9个氨基酸残基 将其进行目标蛋白的C端融合可模拟生物素和链霉抗生物素蛋白特异性相互作用 使用亚胺生物素洗脱 这一系统不能进行N端融合 而且变性剂会影响亲和相互作用 后发展的八氨基酸Streptag 标签 本身并不能生物素化 却可模拟生物素的功能和链霉抗生物素蛋白变体Strep Tactin特异性的相互作用 可加在蛋白的N端和C端 使用便宜的脱硫生物素进行洗脱 且Streptag 和Strep Tactin相互作用不受变性剂影响 可在变性条件下纯化 基于亲合素与生物素的亲合纯化 3 6FLAG标签 T7标签和S标签 FLAG肽序列 DYKDDDDK 亲水性很强 片段小 且具有肠激酶的酶切位点 一般不会影响目标蛋白活性 昂贵 T7标签 T7基因10蛋白的最前面11个氨基酸 通过免疫亲和层析进行纯化 S标签 15个氨基酸的多肽标签 可以特异性的和S 蛋白介质结合 由于S标签和S 蛋白结合形成有活性的核糖核酸酶 可灵敏的定量检测融合蛋白 3 7亲和标签的去除 三种情况不必去除标签 目标蛋白作为免疫原用来产生和纯化抗体 目标蛋白的生物活性不受融合标签的影响 目标蛋白用来直接固定化在介质上 去除法 化学法 廉价 缺乏选择 反应剧烈 酶法 温和 特异性强 成本较高 4 凝胶过滤层析 原理 凝胶过滤层析 也称为分子筛 分子排阻层析 是以多孔性凝胶材料为支持物 当蛋白质溶液流经此支持物时 分子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出 从而达到分离纯化的目的 凝胶介质葡聚糖 glucose 琼脂糖 agarose 聚丙烯酰胺 acrylamide 纤维素 cellulose Pharmacia GE BioGelAagaroseBioGelPacrylamide Bio Rad Sephadexglucose dextrose SepharoseagaroseSephacrylglucose acrylamideSephacelcellulose 原理 HydrophilicNospontaneousbinding ChemicallyandphysicallystableRigidtoallowahighlinearflow rate 应用范围 蛋白质分离 基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小分离 如 凝胶过滤层析纯化细胞色素C分子量测定 蛋白质分子量 球形 的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系 如 高效凝胶过滤色谱法测定沙漠嘎多糖的重均相对分子质量样品脱盐或溶剂置换 如 凝胶过滤 溶液中蛋白质与硫酸铵的分离 5 离子交换层析 原理蛋白质是两性分子 在一定的pH条件下带有电荷 不同的蛋白质所带电荷的种类和数量不同 因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同 利用蛋白质和带电凝胶的作用力差异实现蛋白质的分离 种类阳离子交换柱 凝胶带负电荷 蛋白质带正电荷阴离子交换柱 凝胶带正电荷 蛋白质带负电荷介质惰性支持物 琼脂糖 葡聚糖带电基团 羧甲基 带负电 二乙基氨基 带正电 平衡离子 负电基团的平衡离子氢或钠离子正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子 选择标准 阳离子交换 阴离子交换 应用范围 分离纯化生物大分子物质 蛋白质 多糖 核酸DEAE离子交换层析分离血清蛋白质离子交换层析技术在多糖分离纯化中的应用分离纯化小分子物质 氨基酸 有机酸 抗生素 核苷酸等氨基酸分析仪炭样小单孢菌JXNU 1广谱抗生素产物的分离及其理化性质水处理简单而有效去除水中的杂质及各种离子 聚苯乙烯树脂广泛应用于高纯水的制备 硬水软化以及污水处理等方面 Millipore有机还原剂离子交换树脂废水处理中的应用技术 6 疏水作用层析 原理蛋白质表面的疏水基团与介质的疏水配体的可逆相互作用 高浓度盐增强相互作用 低浓度盐减弱相互作用 方法高离子强度下待分离的样品吸附在疏水介质上 然后降低离子强度选择性将样品解吸 疏水弱的物质先洗脱 疏水强的物质后洗脱 三 常用电泳技术介绍 蛋白质常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 等电聚焦电泳 Isoelectricfocusing IEF 双向电泳 TwoDimensionalElectrophoresis 机制 1 因SDS是阴离子 使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量 消除了原有的电荷差异 2 改变了蛋白质单体分子的构象 不同蛋白质与SDS复合物的短轴长度相同 长轴长度随其分子量的大小呈正比变化 1 SDS PAGE 不连续PAGE分离蛋白质的原理电荷效应浓缩效应快慢离子效应凝胶浓度差效应分子筛效应 电泳法测定未知蛋白的分子量 2 等电聚焦电泳 3 双向电泳 第一向 根据蛋白质的等电点不同进行等电聚焦电泳 第二向 根据分子质量的不同进行SDS PAGE 双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之一 Isoelectricfocusing SDSgelelectrophoresis TwoDimensionalElectrophoresisofE coliProteins morethan2 000proteinswerevisualized 蛋白纯化原则 GuidelinesforProteinPurification 确定目标purity activityandquantity充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性tosimplifytechniqueselectionandoptimization确定活性测定方法fastdetectionofproteinactivity recoveryandcriticalcontaminants尽量减少纯化步骤extrastepsreduceyieldandincreasetime combinestepslogically 纯化目的确定纯化目标 ASSAY Amethodthatmeasurestheamountofaspecificprotein inamixtureofothers Ifpossible theassayshouldgiveanestimateoftheabsoluteconcentration e g mg ml Relativeconcentrationisthenextbest Themethodchosenwillultimatelydependonthepropertiesofthetargetprotein Mostcommonare enzymaticassays ligand bindingassaysimmunologicalassays 活性测定方法的特点 快速 简便 特异和定量 确定活性检测方法 尽量减少纯化步骤 减少每步操作时间toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity reducingrecovery减少添加物additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays早期除去降解物forexample proteases每步使用不同的纯化方法totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparation size charge hydrophobicity ligandspecificity KEEPITSIMPLE 二 蛋白质的性质与功能研究技术 蛋白质鉴定测定蛋白质的浓度凯氏定氮法紫外吸收法分光光度法测定蛋白质的纯度鉴定目标蛋白质蛋白质分子质量与等电点的测定氨基酸组成及顺序分析蛋白质结晶与结构分析蛋白质活性及功能测定 1 蛋白质含量的测定 凯氏定氮法蛋白质平均含氮量为16 测定氮的含量来估算蛋白含量 紫外吸收法芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收 核酸在260nm附近有最大光吸收 经验公式 蛋白质含量 mg mL 1 45 A280 0 74A260分光光度法蛋白质样品与特定的显色剂反应 反应产物在特定波长的光吸收与蛋白质含量成正比 利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量考马斯亮兰法等 Bradford法 2 纯度鉴定 鉴定方法电泳纯 在电泳图谱中仅一条电泳条带色谱纯 在层析图谱中仅一个洗脱峰结晶纯 可获得蛋白质晶体 相互验证 在某一种鉴定方法下表现为均一的蛋白质在另一种方法可能表现为不均一 因此需要互相验证 色谱纯 电泳纯 结晶纯 3 蛋白质鉴定 分子质量及等电点测定 电泳 氨基酸组成与顺序分析蛋白质结晶与结构分析免疫印迹 western blotting 鉴定 3 1氨基酸组成与序列分析 氨基酸组成水解蛋白质为氨基酸全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定顺序分析质谱法推定法 从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列化学法 手工 自动 水解法Sanger法 Edman降解法 氨肽酶法肼解法 羧肽酶法 各类氨基酸序列分析仪器 3 2空间结构分析 二级结构的比例圆二色谱法三维结构X射线晶体衍射法 蛋白质晶体核磁共振 溶液中蛋白质的三维结构电子显微镜 3 3免疫印迹鉴定 原理 免疫印迹步骤凝胶电泳转膜抗原抗体显色反应 STEP1 SDS PAGE STEP2 WESTERNBLOTTING STEP3 IMMUNEFLURESCENCEEMISSION 装置 电泳槽 转印槽 半干转印槽 浸渍转印槽 蛋白质免疫印迹常见问题 纹理和脱尾现象 样品溶解不佳 加样前离心蛋白带过宽 邻近泳道的蛋白加样量过多指示剂成微笑符号 凝胶不均匀冷却指示剂成哭泣符号 凝胶和玻璃板组成 三明治 底部有气泡凝胶时间不对 凝胶太慢可能是TEMED APS剂量不足或失效 凝胶太快 TEMED APS用量过多 胶太硬易裂 SDS PAGE常见问题 Westernblot常见问题 1 技术问题 1 电泳 2 转膜2 抗体问题 特异性 浓度 3 蛋白质丰度4 荧光淬灭 蛋白量过大 1 背景过深2 抗体特异性3 洗膜时间 Westernblot常见问题 1 加样量2 ECL试剂3 曝光时间 Westernblot常见问题 1 蛋白质降解2 蛋白质分子量 内参 Westernblot常见问题 Westernblot常见问题 4 加样量过多 免疫组化和WesternBlot可以用同一种抗体吗 解答 免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇 又称表位 有些表位是线性的 而有的属于构象型 线性表位不受蛋白变性的影响 天然蛋白和煮后的蛋白都含有 构象型表位由于受蛋白空间结构限制 煮后变性会消失 如果抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸 也就是线性表位 那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western 而如果抗体识别构象形表位 则只能用于免疫组化 Westernblot常见问题 在做WesternBlot时 PVDF膜用甲醇浸泡的目的 解答 PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团 使它更容易跟带负电的蛋白质结合 做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上 转移效率低怎么样解决 解答 1 转移缓冲液中加入终浓度20 甲醇 因甲醇可降低蛋白质洗脱效率 但可增加蛋白质和PVDF膜的结合能力 甲醇可防止凝胶变形 甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间 2 用优质的转移膜 或使用小孔径的NC膜 0 2微米 3 低浓度胶 如低至6 太大时还可以考虑用琼脂糖胶 4 提高转移电压 电流 增加转移时间 蛋白分子量大小分别为21kd 28kd 用的是湿转 请问多大电流 多长时间比较合适 解答 分子量比较小 最好是用干转 湿转效率太高 易过 怎样才能把胶跑的非常漂亮 泳道和band都能很直 解答 影响跑胶跑的质量 有以下几个因素 1 电压 小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥 电压越小 条带越漂亮 浓缩胶80v 分离胶100v效果好 2 胶的均匀度 胶越均匀 条带越窄 分离越均匀 倒胶之前 一定要充分混匀 玻璃板一定要干净 双蒸水隔离时 一定要比较轻地加上去 避免稀释下层的分离胶 三 蛋白质的相互作用研究技术 蛋白质相互作用的网络图谱 蛋白质相互作用的重要意义 200种蛋白质及2000种组合结构进行解析后 发现其中1 3的蛋白质相互组合会导致疾病 容易导致疾病的蛋白质和其它蛋白质结合以后也将变得十分活跃 致使发病和病情恶化 绝大多数疾病都是由10万种以上的特定蛋白质相互作用所致 蛋白质相互作用和识别在生物催化 转运 信号传导 免疫 细胞调控等多种生命过程起着重要的作用 一 酵母双杂交技术 YeastTwoHybrid 二 细胞内蛋白质共定位 Co localization 三 谷胱苷肽 S 转移酶沉淀 GST pulldown 四 免疫共沉淀 Co immunoprecipitation Co IP 五 质谱 Massspectrum 一 酵母双杂交系统 酵母激活因子GAL4 N端 147个氨基酸组成的DNA结合域 DNAbindingdomain BD C端 113个氨基酸组成的转录激活域 transcriptionactivationdomain AD BD可以和上游激活序列 upstreamactivatingsequence UAS 结合 而AD则能激活UAS下游的基因进行转录 系统组成部分 1 与BD融合的蛋白表达载体 被表达的蛋白称诱饵蛋白 bait 2 与AD融合的蛋白表达载体 被其表达的蛋白称靶蛋白 prey 3 带一个或多个报告基因的宿主菌株 1 原理 BD X COOH AD cDNA NH2 COOH 共转化 BD X AD Gal4 Gal4 Promoter Reporter Trp Leu cDNAlibrary NH2 Gal4 Gal4 优点 检测在活细胞内进行 体现真核细胞内真实情况可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用可采用不同组织 器官 细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库应用 检测已知蛋白质之间的相互作用确定蛋白质作用功能区域位点确定未知蛋白质之间的相互作用确定基因治疗中多肽类药物的作用机理局限性检测定位于细胞核内的蛋白质间相互作用 假阳性 某些蛋白本身具有激活转录功能融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能 假阴性 不利于核外蛋白研究 2 酵母双杂交的实验步骤 构建诱饵质粒 X BD 将质粒转化酵母菌检测X BD蛋白在酵母中的表达通过酵母生长曲线检测X BD是否有毒性进行自激活测试 将文库质粒共转化入X BD 酵母筛选阳性克隆子 四缺 x gal显色反应 共转化再次确认相互作用将阳性克隆子在二缺平板上划线3次提取酵母质粒 转化E coli 提取质粒PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子DNA测序NCBI数据库搜索 举例 酵母双杂交前准备工作 21kb5kb3 5kb2kb1 5kb M1 构建诱饵质粒 诱饵蛋白的表达 X BD Gal4 BD 检测诱饵蛋白是否有毒性 123 Westernblot1 Yeast2 BD yeast3 X BD yeast 酵母生长曲线1 未转化酵母2 BD 酵母3 X BD 酵母 酵母双杂交结果 X BD Y AD SD Trp Leu Trp Leu His Ade 3 AT 20mM 举例 SD Trp Leu Trp Leu His Ade 3 AT 20mM Gal4 BD Gal4 AD Gal4 BD Y AD X BD Gal4 AD X 半乳糖苷酶蓝白斑显色分析 举例 X BD Y AD X BD gal4 AD Gal4 BD Y AD gal4 BD gal4 AD 酵母双杂交测序结果 酵母双杂交获得的阳性克隆质粒