CN102225219A一种骨组织再生引导膜及其制备方法

CN102225219A一种骨组织再生引导膜及其制备方法 (10)申请公布号102225219A (43)申请公布日xx.10.26102225219A*102225219A* (21)申请号xx10145229.0 (22)申请日xx.06.01A61L31/00(xx.01)A61L31/10(xx.01) (71)申请人陕西博鸿生物科技有限公司地址710065陕西省西安市雁塔区南二环沙坡伟业都市远景10C (72)发明人杨改叶 (74)专利代理机构中国科学院西安专利中心61001代理人任越 (54)发明名称一种骨组织再生引导膜及其制备方法 (57)摘要一种骨组织再生引导膜，本发明采用去抗原的哺乳动物膜组织，具有致密层和疏松层双层结构，致密层由胶原纤维束紧密排列构成，在致密层外侧复合含有活性多肽的胶原涂层，疏松层由胶原纤维相互交错构成，并复合有成骨活性因子。 所制备的引导膜既能阻止软组织长入，又能促进新骨形成，具有良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力，在体内可完全降解，不会产生有害物质；并具有隔离细胞长入作用和缓慢降解的特点，比现有的天然高分子聚合物制备的引导膜在体内留存时间长，能够为新骨生长提供充足的时间和空间。 本发明方法简单、原料广泛且低廉，适合规模化的产业生产，有利于降低医疗成本，减轻患者的负担。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图2页102225226A1/1页21.一种骨组织再生引导膜，其特征在于，所述的引导膜为去抗原处理的哺乳动物膜组织，主要成分为胶原；引导膜具有致密层和疏松层双层结构，其中，致密层由胶原纤维束紧密排列构成，在致密层外侧复合有胶原涂层，胶原涂层中含有PlnDL氨基酸序列或/和RGD肽；疏松层由胶原纤维相互交错构成，疏松层内复合有成骨活性因子。 2.根据权利要求1所述的引导膜，其特征在于，所述的成骨活性因子为骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子或转化生长因子的任一种或是几种的组合。 3.制备权利要求1所述骨组织再生引导膜的方法，其特征在于，是对哺乳动物膜组织去抗原处理，通过脱水和干燥后，再于致密层表面复合含有PlnDL氨基酸序列或/和RGD肽的胶原涂层，并在疏松层复合成骨活性因子。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括步骤 一、制备去抗原膜组织1)、原料预处理取哺乳动物膜组织，去除表面血污及脂肪组织，用生理盐水震荡清洗至少3次；2)、脱脂处理将清洗后的膜组织置入质量体积比为0.1的NaCl溶液中，震荡处理半小时后，再置入乙醚溶剂中超声处理1小时，用质量体积比为2的NaCl溶液冲洗；3)、致密层胰酶处理将脱脂后的膜组织致密面朝外、疏松面朝内扎成袋状，袋内注入PBS缓冲液；将袋状的膜组织置入质量体积比为0.10.4的胰酶溶液中，震荡处理半小时，再置入0.5M的CaCl2溶液中，震荡清洗10分钟后，解开袋用水冲洗，将膜组织从封闭袋状恢复为膜状；4)、NaOH处理将胰酶处理后的膜组织置入浓度为0.010.2M的NaOH溶液中，于04条件下震荡清洗1小时，用纯水冲洗；5)、高渗处理将NaOH处理后的膜组织置入质量体积比为25的NaCl溶液中，震荡清洗2小时后用水冲洗；得到去抗原的天然膜组织；步骤 二、胶原纤维收缩处理将去抗原的膜组织置入丙酮溶液中，震荡处理0.52小时后，用无水乙醇震荡清洗3次；步骤 三、干燥处理将收缩处理后的膜组织平铺于医用不锈钢板表面，使致密面接触钢板，保持钢板50恒温干燥210分钟后，将膜转入-80预冻至少3小时；再经低温冻干，得到具有双层结构的去抗原膜组织；步骤 四、制备含活性多肽的胶原涂层将浓度为530mg/ml的pH7.2的胶原溶液均匀涂布于冻干后膜组织的致密层表面，晾干；该胶原溶液中含有580g/ml的PlnDL氨基酸序列或/和0.22pmol/ml的RGD肽；步骤 五、疏松层复合成骨活性因子在晾干后的膜组织疏松层表面均匀滴加含有20100mg/ml成骨活性因子的PBS溶液，至饱和状态，经低温真空冻干后，完成制备。 权利要求书102225219A102225226A1/6页3一种骨组织再生引导膜及其制备方法技术领域0001本发明属于医用生物材料技术领域，具体涉及一种具有引导骨组织再生作用的生物膜材料及其制备方法。 背景技术0002膜引导组织再生(guided tissueregeneration，GTR)技术在骨组织修复领域已被广泛应用，其原理是通过膜材料的物理屏障作用，阻止软组织细胞进入骨生长区，为骨缺损区域的新骨生长预留空间，并引导成骨类细胞在骨缺损区域生成新骨。 0003GTR技术初期使用的膜在体内不可吸收，如用聚四氟乙烯制备的GTR膜，在使用时必需二次手术取出，给病人带来极大痛苦，并且因其无生物活性，不能用于较大缺损面积的组织再生，限制了在临床使用的范围。 国内外学者一直寻求取材广泛、制备简单、引导骨组织再生效果好的膜材料。 近年来开发的可降解引导膜能够在体内吸收，减少患者二次手术的痛苦和继发感染的风险。 因此，可降解引导膜的研发引起广泛关注，其中以人工合成高分子聚合物(聚乳酸、聚乙醇酸等)、天然高分子聚合物为主要成分的GTR膜较多。 0004以聚乳酸、聚乙醇酸为代表的人工合成高分子聚合物制备的GRT膜，因在体内可降解吸收、机械强度好的优势，已被应用。 中国专利申请xx10105573. 2、xx10053789.6和03117481.7中均以人工合成高分子聚合物为原料，制备具有一定空间结构的GTR膜。 但此类GTR膜也有不足，例如其在体内降解后会产生酸性微环境，引起炎症反应，不利于组织愈合。 0005由胶原蛋白、壳聚糖等天然高分子聚合物制备的GTR膜，在体内降解后不会产生任何有害物质，生物相容性优于人工合成高分子聚合物，已逐渐成为制备GTR膜的主要原料。 但天然高分子聚合物制备的引导膜的机械性能和抗水性能较差、降解过快，与骨组织生长速度不匹配。 中国专利申请xx10071932.1公开了一种双层胶原基引导组织再生材料及其制备方法，为克服胶原材料降解过快的缺陷，其使用化学交联剂来提高材料的抗降解能力，延长再生膜在体内的降解时间；由于戊二醛等化学交联剂在产品中的残留会引起患者机体对产品的排斥，并且其制备方法复杂，对设备条件要求较高，使得成本增高，规模化生产难度大。 0006理想的骨组织再生引导膜应具有致密层和疏松层双层结构，致密层可以防止软组织长入骨缺损区域，为新骨的生长预留空间；疏松层能够提供更大的接触面积，有利于细胞因子吸附及成骨类细胞的贴附生长，加快新骨形成；当然，其还应具有可降解性，无需二次手术取出，确保在体内维持隔离屏障作用一段时间，为新骨生长提供充足时间。 发明内容0007针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种骨组织再生引导膜及其制备方法，所制备的引导膜具有致密层和疏松层双层结构，以及良好的生物相容性，能够延长在体内的降解时间，其降解产物对人体无害。 说明书102225219A102225226A2/6页40008本发明所提出的骨组织再生引导膜的特征在于，所述的引导膜为去抗原处理的哺乳动物膜组织，主要成分为胶原；引导膜具有致密层和疏松层双层结构，其中，致密层由胶原纤维束紧密排列构成，在致密层外侧复合有胶原涂层，胶原涂层中含有能够促进血管形成的串珠样蛋白第一结构功能域(PlnDL)氨基酸序列或/和RGD肽；疏松层由胶原纤维相互交错构成，疏松层内复合有成骨活性因子。 所述的成骨活性因子为骨形态发生蛋白(BMP)、血小板衍生生长因子(PDGF)或转化生长因子(TGF)的任一种或是几种的组合，具体是根据临床应用需要进行选择。 0009本发明所提出骨组织再生引导膜的制备方法，其特征在于，是对哺乳动物膜组织进行去抗原处理，通过脱水和干燥提高膜组织的致密程度，再于致密层表面复合含有PlnDL氨基酸序列或/和RGD肽的胶原涂层，并在疏松层复合成骨活性因子。 本发明制备方法的具体步骤包括0010步骤 一、制备去抗原膜组织00111)、原料预处理取哺乳动物膜组织(如心包膜、腹膜、隔膜等)，去除表面血污及脂肪组织，用生理盐水震荡清洗至少3次；00122)、脱脂处理将清洗后的膜组织置入质量体积比为0.1的NaCl溶液中，震荡处理半小时后，再置入乙醚溶剂中超声处理1小时，用质量体积比为2的NaCl溶液冲洗；0013由于脂肪具有很强的免疫原性，应去除彻底；本环节先采用低渗溶液使膜组织中的胶原纤维松弛分散，再用乙醚溶剂去除脂肪，最后采用高渗溶液使膜组织收缩，使得膜组织的三维空间结构更加紧凑。 00143)、致密层胰酶处理将脱脂后的膜组织致密面朝外、疏松面朝内扎成袋状，袋内注入磷酸盐缓冲液(PBS)；将袋状的膜组织置入质量体积比为0.10.4的胰酶溶液中，震荡处理半小时，再置入0.5M的CaCl2溶液中，震荡清洗10分钟后，解开袋用水冲洗，将膜组织从封闭袋状恢复为膜状；0015由于胰酶能够降解细胞外基质，清除膜组织内的抗原成分；但胰酶也会破坏疏松层的三维结构。 因为致密层与疏松层的结构差异，将膜组织扎成致密面朝外的封闭袋状，采用胰酶处理致密层，既利于去除致密层的抗原成分，又保留了膜组织的天然结构。 00164)、NaOH处理将胰酶处理后的膜组织置入浓度为0.010.2M的NaOH溶液中，于04条件下震荡清洗1小时，用纯水冲洗；0017由于常温下NaOH会破坏天然膜的胶原纤维束结构，缩短引导膜在体内的降解时间，故NaOH处理须保持在04完成。 使用推荐浓度的NaOH溶液能够去除膜组织中大部分具有免疫原性的蛋白及脱脂处理后残余的微量脂肪，并且不会破坏天然膜组织的双层结构。 00185)、高渗处理将NaOH处理后的膜组织置入质量体积比为25的NaCl溶液中，震荡清洗2小时后用水冲洗；得到去抗原的天然膜组织；0019NaOH处理步骤后采用高渗处理，能够去除膜组织中胶原纤维束之间的可溶性非胶原蛋白，进一步降低组织免疫原性。 0020步骤 二、胶原纤维收缩处理将去抗原的膜组织置入丙酮溶液中，震荡处理0.52小时后，用无水乙醇震荡清洗3次；0021由于膜组织中胶原纤维之间的空隙结合有大量的水，丙酮能够使组织脱水，引起说明书102225219A102225226A3/6页5胶原纤维收缩，提高膜组织的致密程度，加强膜的屏障作用；无水乙醇能够清洗膜组织内的丙酮，保持膜组织良好的生物相容性。 0022步骤 三、干燥处理将收缩处理后的膜组织平铺于医用不锈钢板表面，使致密面接触钢板，保持钢板50恒温干燥210分钟后，将膜转入-80预冻至少3小时；再经低温冻干，得到具有双层结构的去抗原膜组织；0023针对膜组织两层不同结构，为加强致密层表面的致密程度，保持疏松层的三维空间结构，采用不会引起胶原纤维变性的50干燥致密层表面，再冷冻干燥膜组织；使所制备膜组织的致密层具有隔离屏障作用，疏松层三维结构有利于吸附血液及活性因子促进新骨形成。 0024步骤 四、制备含活性多肽的胶原涂层将浓度为530mg/ml的pH7.2的胶原溶液均匀涂布于冻干后膜组织的致密层表面，晾干；该胶原溶液中含有580g/ml的PlnDL氨基酸序列或/和0.22pmol/ml的RGD肽；0025其中，所述的均匀涂布可以采用真空旋转涂膜技术，通过旋转速度和时间来控制胶原涂层的致密程度，旋转速度为1000rmp5000rpm，时间为0.52分钟(速度越高，膜的致密程度越高，涂膜时间越长膜的厚度越大)；本发明通过在致密层表面制备的致密胶原涂层的物理屏障作用，能够提高致密面阻挡非成骨细胞长入的能力，保证骨缺损区域新骨生长所需的空间。 0026串珠样蛋白第一结构功能域氨基酸序列(简称PlnDL氨基酸序列)是一种氨基酸功能片段，能够在低浓度环境下促进血管形成，活性较血管内皮生长因子高；获取方法可参考Soluble perlecandomain ienhances vascularendothelial growthfactor-165activity andreceptor phosphorylationin humanbone marrowendothelial cells，BMC Biochemistryxx，1143。 0027RGD肽即精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸多肽，是ECM蛋白与相应细胞的结合位点，它能与被粘附细胞的细胞膜整合素亚基识别并与之结合，促进细胞代谢和蛋白质合成，增强细胞附着、增殖、分化；被广泛用于对生物材料的表面处理，获取方法可以参考生物活性短肽RGD的合成及其在PET表面接枝方法的研究，四川大学硕士论文，xx。 0028步骤 五、疏松层复合成骨活性因子在晾干后的膜组织疏松层表面均匀滴加含有20100mg/ml成骨活性因子的PBS溶液，至饱和状态，经低温真空冻干后，完成制备。 0029本发明的骨组织再生引导膜为天然膜组织，主要成分为胶原，具有良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力，在体内可完全降解，不会产生有害物质；由于原料采用具有隔离屏障作用的哺乳动物膜组织，经过对材料的致密处理，所制备的引导膜具有隔离细胞长入作用和缓慢降解的特点，比现有的天然高分子聚合物制备的引导膜在体内留存时间长，能够为新骨生长提供充足的时间和空间。 动物实验证明，在大鼠皮下同期植入本发明引导膜和现有技术的胶原基引导膜，每周取样观察，在4周时胶原基引导膜开始降解，至67周已降解一半以上，引导膜不再具有隔离屏障作用；而本发明引导膜从第8周开始降解，16周时膜组织变薄，但仍能观察到完整膜结构的存在，至22周时膜组织完全降解，未见不良反应。 0030本发明的引导膜具有理想骨组织再生引导膜所要求的致密层与疏松层双层结构，既能阻止软组织长入，又能促进新骨形成；疏松层在植入缺损位点后能够吸附周围组织的说明书102225219A102225226A4/6页6血液，形成血凝块，加速愈合；在致密层表面复合有促进血管形成的PlnDL氨基酸序列和促进细胞贴附的RGD肽，有利于创面愈合；PlnDL氨基酸序列比血管内皮生长因子的活性更稳定，且能在较低浓度发挥促血管生成作用；RGD肽能够人工合成、无免疫原性、无携带病毒的危险、花费较低，在不同质地材料表面有较高的稳定性，不受温度和pH变化的影响，易储藏运输。 由于在疏松层加入了促进新骨生长的生长因子，具有骨诱导活性，能进一步促进骨组织重建。 本发明制备方法简单、原料广泛且低廉，适合规模化产业生产，有利于降低医疗成本，减轻患者的负担。 附图说明0031附图1为本发明方法所制备的骨组织再生引导膜的大体照片；附图2为图1所示引导膜的致密层局部扫描电子显微照片，可见致密层表面光滑致密，能有效阻止软组织长入；附图3为图1所示引导膜的疏松层局部扫描电子显微照片，可见疏松层空隙结构明显，能有效促进新骨形成。 具体实施方式0032以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。 0033实施例 1、0034步骤 一、制备去抗原膜组织00351)、原料预处理取猪心包膜，去除表面血污及脂肪组织，用生理盐水震荡清洗3次，每次15分钟；00362)、脱脂处理将清洗后的膜组织置入0.1(M/V)的NaCl溶液中，震荡处理半小时，再置入乙醚(分析纯)溶剂中超声处理1小时，用2(M/V)的NaCl溶液冲洗；00373)、致密层胰酶处理将脱脂后的膜组织致密面朝外、疏松面朝内扎成袋状，袋内注入PBS缓冲液；将袋状的膜组织置入质量体积比为0.2的胰酶溶液中，震荡处理半小时，再置入0.5M的CaCl2溶液中，震荡清洗10分钟后，解开袋用水冲洗，将膜组织从封闭袋状恢复为膜状；00384)、NaOH处理将胰酶处理后的膜组织置入0.02M浓度的NaOH溶液中，于04条件下震荡清洗1小时，用纯水冲洗1小时；00395)、高渗处理将NaOH处理后的膜组织置入质量体积比为2的NaCl溶液中，震荡清洗2小时后用水冲洗，得到去抗原的天然膜组织；0040步骤 二、胶原纤维收缩处理将去抗原的膜组织置入丙酮溶液(分析纯)中，震荡处理半小时后，用无水乙醇震荡清洗3次，每次1小时；0041步骤 三、干燥处理将收缩处理后的膜组织平铺于医用不锈钢板表面，使致密面接触钢板，保持50恒温干燥2分钟后，迅速将膜组织转入-80低温预冻3小时；再经低温冻干，得到具有双层结构的去抗原膜组织；0042步骤 四、制备含PlnDL氨基酸序列的胶原涂层将浓度为9mg/ml的pH7.2的胶原溶液采用真空旋转涂膜技术(速度2000rpm，时间1分钟)，均匀涂布于冻干后膜组织的致密层表面，晾干；该胶原溶液中含有20g/ml的PlnDL氨基酸序列；0043步骤 五、疏松层复合成骨活性因子在晾干后的膜组织疏松层表面均匀滴加含有说明书102225219A102225226A5/6页750mg/ml成骨活性因子的PBS溶液，至疏松层呈现饱和状态，成骨活性因子采用血小板衍生生长因子(PDGF)；经低温真空冻干后，完成制备。 0044所制备的骨组织再生引导膜厚度约400m，一面含有促血管形成的活性氨基酸序列，一面复合有促进成骨的活性因子，适用于牙周组织引导再生术，也可与骨移植材料配合使用，治疗由牙周炎引起的牙周骨缺损。 0045实施例 2、0046步骤 一、制备去抗原膜组织00471)、原料预处理取猪腹膜，去除表面血污及脂肪组织，用生理盐水震荡清洗3次，每次15分钟；00482)、脱脂处理将清洗后的膜组织置入0.1(M/V)的NaCl溶液中，震荡处理半小时后，再置入乙醚(分析纯)溶剂中超声处理1小时，用2(M/V)的NaCl溶液冲洗；00493)、致密层胰酶处理将脱脂后的膜组织致密面朝外、疏松面朝内扎成袋状，袋内注入PBS溶液；将袋状的膜组织置入质量体积比为0.3的胰酶溶液中，震荡处理半小时，再置入0.5M的CaCl2溶液中，震荡清洗10分钟后，解开袋用水冲洗，将膜组织从封闭袋状恢复为膜状；00504)、NaOH处理将胰酶处理后的膜组织置入浓度为0.05M的NaOH溶液中，于04条件下震荡清洗1小时，用纯水冲洗；00515)、高渗处理将NaOH处理后的膜组织置入质量体积比为3的NaCl溶液中，震荡清洗2小时后用水冲洗；得到去抗原的天然膜组织；0052步骤 二、胶原纤维收缩处理将去抗原的膜组织置入丙酮溶液(分析纯)中震荡处理1小时后，用无水乙醇(分析纯)震荡清洗3次，每次1小时；0053步骤 三、干燥处理将收缩处理后的膜组织平铺于医用不锈钢板表面，使致密面接触钢板，保持50恒温干燥5分钟后，迅速将膜转入-80低温预冻3.5小时；再经低温冻干；得到具有双层结构的去抗原膜组织；0054步骤 四、制备含RGD肽的胶原涂层将浓度为16mg/ml的pH7.2的胶原溶液采用真空旋转涂膜技术(速度2500rpm，时间80s)，均匀涂布于冻干后膜组织的致密面，晾干，该胶原溶液中含1pmol/ml的RGD肽；0055步骤 五、疏松层复合成骨活性因子在晾干后的膜组织疏松层表面均匀滴加含有80mg/ml成骨活性因子的PBS溶液，至疏松层呈现饱和状态，成骨活性因子采用骨形态发生蛋白(BMP)；经低温真空冻干后，完成制备。 0056所制备的骨组织再生引导膜厚度约1000m，一面含有促进周围组织细胞贴附生长的RGD肽，一面复合有促进成骨的活性因子，适用于较大范围的牙槽嵴扩增与重建。 0057实施例 3、0058步骤 一、制备去抗原膜组织00591)、原料预处理取牛心包膜，去除表面血污及脂肪组织，用生理盐水震荡清洗3次，每次15分钟；00602)、脱脂处理将清洗后的膜组织置入0.1(M/V)的NaCl溶液中，震荡处理半小时后，再置入乙醚(分析纯)溶剂中超声处理1小时，用