CN1019xx1A免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法

CN1019xx1A免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法 (10)申请公布号1019xx1A (43)申请公布日xx.12.221019xx1A*1019xx1A* (21)申请号xx10130747.0 (22)申请日xx.03.23A61K48/00(xx.01)A61K39/295(xx.01)A61K39/29(xx.01)A61P31/20(xx.01) (71)申请人中国人民解放军第三军医大学地址400038重庆市沙坪坝区高滩岩正街29号 (72)发明人吴玉章杨曌 (74)专利代理机构北京同恒源知识产权代理有限公司11275代理人赵荣之 (54)发明名称免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法 (57)摘要本发明公开了免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法，该疫苗为HBcAg表位肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽与LIGHT基因重组表达载体的复合物；HBcAg表位肽/HBsAg表位肽/HBeAg表位肽分别由表位HBcAg87-95/HBsAg172-180/HBeAg147-155与穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成，穿膜序列位于氨基端，内质网滞留信号序列位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间以接头序列连接；该疫苗可成功进入细胞并靶向内质网，有效促进乙肝病毒蛋白抗原表位进入MHC-I类抗原递呈途径激发特异性CTL应答。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图2页*1019xx1A*1019xx1A1019xx1A1019xx2A1/1页21.免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，其特征在于该疫苗为乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽、乙肝病毒e抗原表位肽与LIGHT基因重组表达载体的复合物；所述乙肝病毒核心抗原表位肽由乙肝病毒核心抗原表位HBcAg87- 95、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成；所述乙肝病毒表面抗原表位肽由乙肝病毒表面抗原表位HBsAg172- 180、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成；所述乙肝病毒e抗原表位肽由乙肝病毒e抗原表位HBeAg147- 155、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成；在所述乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，内质网滞留信号序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间均以接头序列连接。 2.根据权利要求1所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，其特征在于所述接头序列为AAY。 3.根据权利要求1所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，其特征在于所述乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的摩尔比为111。 4.根据权利要求1所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，其特征在于所述LIGHT基因重组表达载体是在真核表达载体PCI-neo中插入LIGHT cDNA全长序列而得到。 5.权利要求1所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备方法，其特征在于在搅拌条件下，向溶解有LIGHT基因重组表达载体的磷酸盐缓冲液中滴加溶解有乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的水溶液，滴加完毕后继续搅拌30分钟，再静置30分钟，即得。 6.根据权利要求5所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备方法，其特征在于所述乙肝病毒核心抗原表位肽、乙肝病毒表面抗原表位肽和乙肝病毒e抗原表位肽的摩尔比为111。 权利要求书1019xx1A1019xx2A1/6页3免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法技术领域0001本发明涉及一种多价疫苗，特别涉及一种免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。 背景技术0002乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。 乙型病毒性肝炎简称乙肝，是由HBV引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。 目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我国约占半数。 此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。 目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物如-干扰素和拉米夫定等进行治疗，但疗效都不甚理想。 -干扰素治疗慢性乙肝的近期应答率为4060，用药后1年的应答率仅为2040，且治疗时可发生与剂量相关的副作用。 拉米夫定治疗慢性乙肝持续用药1年时，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴转率为2025，HBeAg血清转换率为1520，治疗时间长易出现耐药及HBV DNA多聚酶基因酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸(YMDD)变异，停药后常导致反跳。 因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。 0003研究发现，HBV感染的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。 在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。 因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性HBV感染。 0004目前，我国还没有乙肝治疗性疫苗正式上市，国内很多单位都在进行乙肝治疗性疫苗的研究，从目前研究结果来看，乙肝治疗性疫苗较现有抗病毒药物疗效更好。 在乙肝治疗性疫苗的研制中，基于乙肝病毒蛋白抗原CTL表位的多肽疫苗的研制是一个重要方向。 但是，单纯的多肽疫苗存在免疫原性弱、半衰期短及不易被APC摄取等固有缺陷，必须对其进行修饰、改进。 0005CTL是通过其T细胞受体(TCR)特异性识别抗原递呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子-肽复合物而得以活化，并最终杀死靶细胞。 其中，与MHC-I类分子特异性结合的短肽即CTL表位在CTL活化过程中起关键作用。 但大多数MHC-I类分子只递呈内源性抗原。 外源性抗原绝大多数进入MHC-II类抗原递呈途径以激活辅助性T细胞(Th细胞)，仅有少数可被MHC-I类分子递呈，即交叉递呈。 因此，如何将外源性短肽有效投入APC内MHC-I类抗原递呈途径是激发特异性CTL应答的关键，也是基于表位开发疫苗的瓶颈问题。 0006由于细胞膜的屏障作用，生物大分子不能自由进入细胞。 近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)相继被发现，其可有效携带外源性大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。 这些具有细胞穿透能力的多肽被命名为细胞穿膜肽(CPP)。 研究最早的CPP为人类免疫缺陷病毒(HIV)-1的反式激活蛋说明书1019xx1A1019xx2A2/6页4白Tat。 1988年，Green和Frankel证实Tat能跨膜转移到细胞质和细胞核内。 1997年，Vives等发现Tat中一个富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽片段与蛋白转导功能密切相关，称之为蛋白转导域。 进一步研究发现，由Tat第49-57位氨基酸残基组成的序列(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，RKKRRQRRR)即可完全行使蛋白转导的功能，这是Tat既有穿膜特性又无细胞毒性的最小片段。 另外，研究发现，Tat49-57可有效促进与之偶联的外源CTL表位进入MHC-I类抗原递呈途径，表现为动力学显著增强，且该过程表现为蛋白酶体/TAP非依赖、氨基肽酶依赖。 0007内质网(ER)是MHC-I类分子递呈抗原肽的最重要场所，若使外源性抗原肽靶向转运至ER腔，可望增强外源性抗原肽被MHC-I类分子提呈的效率。 研究发现，ER滞留信号赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸(Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL)基序可明显增强与之偶联的外源CTL表位在APC内的MHC-I类抗原递呈效率，并且显著延长APC表面MHC-肽复合物的递呈时间，提示羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-I类抗原递呈途径的一个简单有效的新策略。 0008LIGHT(homologous tolymphotoxins，inducible，petes withHSVglycoprotein Dfor HVEM，expressed byTlymphocyte)是一个新发现的肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员。 LIGHT基因定位于人类染色体16p11.2，LIGHT mRNA高表达于脾脏、激活的T细胞和巨噬细胞。 LIGHT蛋白为典型的II型跨膜蛋白，其一级结构由240个氨基酸组成，包括胞质内位于N端的37个氨基酸、跨膜区的22个氨基酸以及胞外区的181个氨基酸，其第102位氨基酸残基为N-端糖基化位点。 研究发现，LIGHT可与3种不同的受体淋巴毒素受体(LTR)、单纯疱疹病毒侵入介导物(HVEM)及诱骗受体(DcR3)结合，通过非半胱天冬氨酸蛋白酶和非CD28依赖途径分别诱导肿瘤细胞的凋亡和共刺激T细胞的活化。 发明内容0009有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，目的之二在于提供所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备方法。 0010为达到上述目的，本发明采用如下技术方案0011 1、免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗，该疫苗为乙肝病毒核心抗原(HBcAg)表位肽、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)表位肽、乙肝病毒e抗原(HBeAg)表位肽与LIGHT基因重组表达载体的复合物；0012所述HBcAg表位肽由表位HBcAg87- 95、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头(linker)序列组成；0013所述HBsAg表位肽由表位HBsAg172- 180、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成；0014所述HBeAg表位肽由表位HBeAg147- 155、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成；0015在所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽中，穿膜序列均位于氨基端，内质网滞留信号序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间均以接头序列连接。 0016进一步，所述接头序列为AAY；说明书1019xx1A1019xx2A3/6页50017进一步，所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的摩尔比为111；0018进一步，所述LIGHT基因重组表达载体是在真核表达载体PCI-neo中插入LIGHT cDNA全长序列而得到。 0019 2、所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备方法，是在搅拌条件下，向溶解有LIGHT基因重组表达载体的磷酸盐缓冲液中滴加溶解有HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的水溶液，滴加完毕后继续搅拌30分钟，再静置30分钟，即得。 0020进一步，所述HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的摩尔比为111。 0021本发明的有益效果在于本发明疫苗可通过穿膜序列进入细胞，再通过内质网滞留信号序列靶向并滞留于内质网，有效促进乙肝病毒蛋白抗原表位HBcAg87-95/HBsAg172-180/HBeAg147-155进入MHC-I类抗原递呈途径激发特异性CTL应答，同时LIGHT发挥免疫佐剂作用，共刺激T细胞活化，从而产生广泛的免疫激活效应，诱导强有力的抗病毒免疫。 动物实验结果证实，本发明疫苗能够激发CTL分泌干扰素-(IFN-)；能够激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，使HBV转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性明显升高；还能够抑制HBV的复制，显著降低HBV转基因小鼠血清HBV DNA载量。 本发明疫苗制备方法简单，成本低廉，在慢性HBV感染治疗领域有着较好的开发应用前景。 附图说明0022为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中0023图1为HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的一级结构示意图；0024图2为LIGHT基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；0025图3为本发明疫苗的透射电镜图；0026图4为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测本发明疫苗激发CTL分泌IFN-的能力；0027图5为给予本发明疫苗后HBV转基因小鼠血清ALT活性检测结果；0028图6为给予本发明疫苗后HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测结果。 具体实施方式0029以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。 优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，xx年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 0030 一、免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的制备0031 1、HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的设计与合成0032本发明设计的HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽的一级结构如图1所示，各表位与穿膜序列或内质网滞留信号序列之间以接头序列连接，以便于各表位保持独立性和能够有效递呈。 在本实施例中，接头序列为丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸(Ala-Ala-Tyr，AAY)；HBcAg表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，HBsAg表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，HBeAg表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示；同时，以卵清蛋白(OVA)表位肽作为对照肽(由表位OVA257- 264、穿膜序列HIV-Tat49- 57、内质网滞留信号序列KDEL和接头序列组成，其氨基酸序列如SEQ IDNo.4所示。 说明书1019xx1A1019xx2A4/6页60033多肽的合成在ABI431A型固相多肽合成仪(美国PE公司)上进行。 方法采用标准芴甲氧羰基(Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。 起始选用0.125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂(HMP树脂)，按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸的用量为0.5mmol，与树脂的摩尔比为41。 各种氨基酸的-氨基为Fmoc保护，其余侧链保护基团分别为Lys(Boc)、Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)、His(Trt)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。 第一个氨基酸连接到树脂上用4-二甲氨基吡啶(DMAP)，氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑(HOBt)和二环己基碳二亚胺(DCC)，偶联后用体积分数为20的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。 多肽合成后，将树脂-粗肽产品在冰浴条件下混合于10mL切割液A(由结晶苯酚0.75g、1，2-乙二硫醇即EDT0.25mL、苯甲硫醚0.5mL、去离子水0.25mL和三氟乙酸即TFA10mL组成)中，待切割液温度上升至室温后，搅拌反应2小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。 将反应混合液经G4玻砂漏斗过滤以去除树脂，先后用1mL TFA、510mL二氯甲烷反复冲洗反应瓶、树脂和漏斗。 将滤液在常温低压下蒸发至12mL，加入50mL预冷乙醚沉淀多肽，4放置过夜，G6玻砂漏斗过滤，真空抽干，即得多肽粗品，-20保存备用。 0034将多肽粗品用二甲基亚砜(DMSO)溶解制成浓度为20mg/mL的溶液，经孔径为0.45m的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer100型中压液相色谱仪(瑞典Amerssham Bioscienc公司)上用SOURCE凝胶柱进行纯化。 流动相A由体积百分含量为10的乙醇和体积百分含量为0.1的TFA组成，流动相B由体积百分含量为90的乙醇和体积百分含量为0.1的TFA组成；洗脱梯度为先用流动相A1.5个柱体积洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0逐渐增加至80)洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液(流动相B占混合液的体积分数在0.5个柱体积内由80逐渐增加至100)洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得多肽纯品，用DMSO溶解，-20保存备用。 0035将多肽纯品用Delta600型高压液相色谱仪(美国Waters公司)鉴定纯度，采用Symmetry ShieldTM C18柱，流动相由体积百分含量为1060的乙腈和体积百分含量为0.1的TFA组成，梯度洗脱，流速为1mL/min。 结果显示，合成多肽的纯度均达到90以上。 同时，将多肽纯品用API2000LC/MS型电喷雾离子化质谱仪测定分子量。 结果显示，合成多肽的分子量均与理论值相符。 0036 2、LIGHT基因重组表达载体的构建0037收集人外周血单个核细胞(PBMC)，用重组白介素4(rIL-4)和重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rGM-CSF)诱导分化成未成熟树突状细胞(DC)，用RNA抽提试剂盒抽提未成熟DC细胞总RNA，紫外分光光度法测定浓度和纯度后，-70保存备用。 0038根据GenBank登录号为NM_003807的LIGHT基因的完整开放阅读框ORF，设计如下PCR引物上游引物5-cttgggcatggaggagagtgtcgta-3(SEQ IDNo.6)，下游引物5-tcacaatgaaaggaagtaag-3(SEQ IDNo.7)，上下游引物两端未加限制性酶切位点。 PCR引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。 0039将未成熟DC细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用上述上下游引物PCR扩增LIGHT cDNA全长，PCR体系总体积为100L，PCR循环条件参数为94预变性2分钟；再94变性30秒、60退火30秒、72延伸1分钟，共30个循环；最后72延伸说明书1019xx1A1019xx2A5/6页710分钟。 将PCR产物经质量分数为1的琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果如图2所示，M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在分子量约720bp处有唯一条带，与预期分子量相符)后，切胶回收纯化，再与T载体pGEM-T Easy在T4DNA连接酶作用下于16连接过夜，连接产物转化DH5感受态细菌，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养后提取质粒，用限制性内切酶EcoR I和Pst I进行双酶切鉴定，并委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序验证，正确插入了LIGHT cDNA全长序列(SEQ IDNo.5)的阳性克隆质粒命名为LIGHT-pGEM-T Easy。 0040用EcoR I从LIGHT-pGEM-T Easy中酶切出LIGHT cDNA全长，经质量分数为1的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化，紫外分光光度法测定浓度；同时，用EcoR I使真核表达载体PCI-neo线性化，经质量分数为1的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收纯化，紫外分光光度法测定浓度；再将LIGHT cDNA全长与线性化载体pCI-neo在T4DNA连接酶作用下于16连接过夜，连接产物转化DH5感受态细菌，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆单菌落，用含有氨苄青霉素的LB培养基过夜培养后提取质粒，用EcoR I和Kpn I进行双酶切鉴定，所得阳性克隆质粒命名为LIGHT-pCI-neo。 0041 3、HBcAg表位肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽与LIGHT基因重组表达载体的复合物的制备0042将LIGHT-pCI-neo用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解制成浓度为500g/mL的溶液，取该溶液100L，在混旋状态下以5L/min的速度滴加总浓度为1000g/mL的多肽溶液(由摩尔比为111的HBcAg表位肽、HBsAg表位肽和HBeAg表位肽组成)100L，滴加完毕后继续混旋30分钟，再静置30分钟，即得HBcAg表位肽、HBsAg表位肽、HBeAg表位肽与LIGHT基因重组表达载体的复合物，也即本发明所述免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗。 0043透射电镜分析将新制复合物滴于200目铜网上，吸附3分钟，用吸水纸吸干，晾干30秒，以质量体积百分浓度为1的醋酸铀水溶液负染30秒，用吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。 结果如图3所示，所得复合物呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。 0044 二、免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗的抗病毒活性研究0045效应细胞的制备将30只68周龄雌性HBV转基因Babl/c小鼠随机分为3组实验组、对照组和空白组，每组10只；实验组以浓度为0.5mg/mL的本发明疫苗为免疫原，对照组以浓度为0.5mg/mL的OVA表位肽与LIGHT-pCI-neo的复合物为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100L，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。 0046 1、ELISPOT法检测本发明疫苗激发CTL分泌IFN-的能力0047末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有体积百分浓度为10的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1106个/mL，即得效应细胞悬液；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70的乙醇溶液100L，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-捕说明书1019xx1A1019xx2A6/6页8获抗体(稀释度为1100)100L，温度4孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2的脱脂奶粉溶液100L，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞悬液100L，温度37孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-抗体(稀释度为1100)100L，温度37孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为15000)100L，温度37孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100L，室温避光显色210分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞悬液)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。 0048结果如图4所示，实验组的斑点数明显高于对照组、空白组，表明本发明的疫苗复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN-。 0049 2、HBV转基因小鼠血清ALT活性检测0050末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清ALT活性。 0051结果如图5所示，实验组的血清ALT活性明显高于对照组和空白组，表明本发明疫苗能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，从而导致血清ALT活性明显升高。 0052 3、HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测0053末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清HBV DNA抑制率。 0054结果如图6所示，实验组的血清HBV DNA抑制率明显高于对照组和空白组，表明本发明疫苗能够有效抑制HBV的复制，显著降低血清HBV DNA载量。 0055最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。 说明书1019xx1A1019xx2A1/3页9序列表中国人民解放军第三军医大学免疫增强型乙肝治疗性多价疫苗及其制备方法7128PRT人工序列乙肝病毒核心抗原表位肽1Arg LysLys Arg Arg GlnArg Arg Arg Ala Ala TyrSer TyrVal Asn151015Thr AsnIle AlaLeu AlaAla Tyr Lys Asp Glu Leu2025228PRT人工序列乙肝病毒表面抗原表位肽2Arg LysLys Arg Arg GlnArgArgArg AlaAla TyrTrp LeuSer Leu151015Leu ValPro PheVal AlaAla TyrLys AspGlu Leu2025328PRT人工序列乙肝病毒e抗原表位肽3Arg LysLys ArgArg GlnArgArgArg AlaAla TyrTyr LeuVal Ser151015序列表1019xx1A1019xx2A2/3页1