CN102526717A一种吸附无细胞百白破联合疫苗的制备方法

CN102526717A一种吸附无细胞百白破联合疫苗的制备方法 (10)申请公布号102526717A (43)申请公布日xx.07.04102526717A*102526717A* (21)申请号xx10382612.8 (22)申请日xx.11.25A61K39/116(xx.01)A61P31/04(xx.01)A61K39/05(xx.01)A61K39/08(xx.01)A61K39/10(xx.01) (71)申请人成都康华生物制品有限公司地址610100四川省成都市国家经济技术开发区北京路182号 (72)发明人侯文礼廖常茹冯晓赵志鹏钟泽荣 (74)专利代理机构四川省成都市天策商标专利事务所51213代理人刘兴亮 (54)发明名称一种吸附无细胞百白破联合疫苗的制备方法 (57)摘要本发明涉及利用百日咳、白喉、破伤风菌种培养类毒素制备百白破疫苗的方法，所述方法采用硫酸铵盐析、密度梯度离心、戊二醛脱毒的方式来制备包含有效抗原PT和FHA的无细胞百日咳原液，通过将制备所得到的百日咳原液与精致纯化得到的白喉类毒素和破伤风毒素混合最终制备得到可用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病的无细胞百白破联合疫苗。 (51)Int.Cl.权利要求书2页说明书10页附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图1页1/2页21.一种制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其通过将制备所得到的百日咳原液与精致纯化得到的白喉类毒素和破伤风毒素混合最终制备得到可用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述方法包括如下步骤 (1)采用包括戊二醛解毒步骤的方法来制备包含有效抗原PT和FHA的无细胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最终浓度为0.5，置于20脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使其最终浓度为0.2，置于20作用3小时； (2)采用包括甲醛解毒步骤的方法来制备白喉类毒素和破伤风毒素，其中制备白喉类毒素时甲醛解毒的具体操作条件为选择0.5的甲醛，经调pH至7.07.2，在3739下脱毒，然后加入赖氨酸(9.125)，脱毒42天左右；制备破伤风毒素时甲醛解毒的具体操作条件为甲醛0.15，放置于37温箱中加温脱毒25天。 2.权利要求1所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于用于制备百日咳原液的菌种为百日咳I相菌种58003(CS)。 3.权利要求1所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于百日咳I相菌种58003(CS)的接种发酵罐培养条件为将配制好SSM培养基加入10L发酵罐，接种细菌的培养浓度为3.0108/ml，培养温度为37，通气量4060L/min，压力0.1kg/cm2，搅拌器的转速设定为350rpm。 4.权利要求1所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于制备无细胞百日咳原液的方法还包括硫酸铵盐析、密度梯度离心步骤。 5.权利要求4所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于制备无细胞百日咳原液的硫酸铵盐析是二次盐析。 6.权利要求5所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于硫酸铵盐析的具体操作条件如下收集培养物并加入低浓度的硫酸铵进行一次盐析，7日后经3500rpm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟，经7000rpm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rpm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rpm离心3小时后收取上层清液。 7.权利要求4所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于制备无细胞百日咳原液的密度梯度离心是经30000rpm蔗糖密度梯度离心1820小时除去内毒素，收集糖浓度为412之间的样品。 8.权利要求1所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于在制备无细胞百日咳原液时，进行戊二醛脱毒后，将所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，进行戊二醛残量检测。 9.权利要求1所述的制备吸附无细胞百白破联合疫苗的方法，其特征在于制备得到的百日咳原液、白喉类毒素和破伤风毒素后，配置13mg/ml的氢氧化铝，高压灭菌，将氢氧化铝用生理盐水稀释至24mg/ml，将百日咳原液、精制白喉和破伤风类毒素加入氢氧化铝，于20-25搅拌吸附4小时。 10.权利要求9所述的方法制备得到的吸附无细胞百白破联合疫苗，其特征在于获得百日咳有效抗原PT和FHA，经过检测这两种有效抗原的纯度达到85以上，且含无细胞权利要求书102526717A22/2页3百日咳疫苗效价应不低于4.0IU，白喉疫苗效价应不低于30IU，破伤风疫苗效价应不低于40IU。 权利要求书102526717A31/10页4一种吸附无细胞百白破联合疫苗的制备方法技术领域0001本发明属于生物医学技术领域，本发明涉及利用百日咳、白喉、破伤风菌种培养类毒素制备成百白破疫苗，用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病。 背景技术0002百日咳是一种常见的、传染性极强的呼吸道感染性疾病。 百日咳病在中医上称为天哮呛、鹭鹚吼、疫咳等，我国早在十一世纪就有关于此病的治疗方法。 1840年Monlton提到过百日咳病，1876年Sydenham详细描述了该病，称之为剧烈咳嗽的病。 1900年由Bordet和Gengon在患儿的咳痰涂片内找到了百日咳杆菌。 由于该菌初次分离营养要求较高，直到1906年他们采用了血液-甘油-马铃薯培养基才获得纯种。 百日咳杆菌能引起人类急性呼吸道传染病，传染力强，发病持续时间长，故称百日咳(whoop cough或Pertussis)。 百日咳杆菌能引起人类百日咳，以婴幼儿患者居多，主要是易感者与患者密切接触后，通过飞沫空气传播感染。 百日咳病程较长，大约57周或更长，常见有流感嗜血杆菌、A群链球菌和肺炎球菌的继发感染，具有严重的预后结果，最常见的合并症为肺炎，是导致百日咳患儿死亡的主要原因。 在患病的早期使用抗生素可能有效，百日咳杆菌对红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、多粘菌素等抗生素均有较敏感。 若在百日咳潜伏期和卡他期立即使用这些药物可以缩短病程，减轻病情。 但是，如果进入了百日咳痉咳期，则所有抗菌素效果都不明显。 百日咳杆菌致病机理至今尚不十分清楚。 但体液内存在一定的抗体水平可保护机体免受百日咳杆菌感染已被证实。 自20世纪30年代Medson等制成百日咳菌体疫苗以来，已在世界各国使用近60年。 百日咳菌体疫苗在预防和控制百日咳中发挥了巨大的作用，使百日咳成为用疫苗可以预防的传染病，已列入世界卫生组织推行的扩大免疫计划(Expend ProgrammeImmunization，EPI)中要控制的和消灭的传染病之一。 0003破伤风是一种严重的疾病，它多发生于创伤后，由于患者伤口被破伤风杆菌感染，在厌氧的条件下产生大量的毒素，进而侵害神经组织，导致患者全身性肌肉强直和阵发性痉挛，死于窒息及全身性衰竭。 它多是散在发生，感染与发病也需要特定的条件，即创伤、污染、破伤风杆菌及厌氧条件。 破伤风杆菌产生的毒素经甲醛解毒后，形成类毒素，可用于人群免疫接种，形成自动免疫，该方法是1925年通过动物法注射类毒素后，在血清中可测出相应的抗体，并能抗破伤风感染。 0004白喉是一种严重的世界性的呼吸道传染病，人类是白喉杆菌的唯一宿主。 它是由白喉棒状杆菌侵入到上呼吸道粘膜上皮组织，生长繁殖并产生外毒素引起炎症，产生纤维性渗出和组织破坏，形成典型的假膜，这种假膜牢固的附着在粘膜上，可引起呼吸障碍甚至窒息，同时白喉外毒素不断由病灶吸收，引起全身性中毒性症状、器官损害和急性死亡，主要是心肌、神经系统、肝、肾及肾上腺等器官的损害。 自1923年发现经用甲醛处理白喉毒素后，可使白喉毒素的毒性消失而保持免疫原性，注射动物可产生中和抗体。 0005我国目前应用于计划免疫预防百日咳、白喉、破伤风疾病的疫苗主要是在全细胞百日咳疫苗中加入白喉、破伤风类毒素的联合疫苗。 自五十年代初我国已经开始生产该种说明书102526717A42/10页5疫苗，至今已使用了半个多世纪。 虽然近半个世纪以来，在世界范围内许多国家已经广泛应用了疫苗，大大降低了白喉和破伤风疾病的发病率，但有关研究表明，在疫苗接种不完全区域的人群中仍时有百日咳和白喉发生，处于地方性低水平流行。 在20世纪70年代末至80年代初，在一些发达国家，如英国、瑞典、意大利和日本等由于停止百日咳菌体疫苗接种，发病率大幅度上升。 1993年瑞典报告在未免疫的儿童中，60在10岁前发生过典型的百日咳症状，其中90儿童的血清百日咳毒素抗体呈阳性反应。 因此，百日咳疫苗接种的长期性和保证完成全程免疫是非常重要和关键。 根据WHO近期统计，全球每年仍有百日咳病人近4000万，35.7万人死亡。 如非洲，发病率为2000/10万，5岁以下儿童的发病率高达2060。 在欧洲发病率约为0.35/10万85/10万。 在美国，百日咳的发病率从1981年的0.5/10万增加到1993年的2.6/10万；澳大利亚尽管3针基础免疫覆盖率高达90，百日咳发病率从1991年的2/10万增加到1994年的30.5/10万。 在荷兰疫苗接种率高达95，1996年仍发生了大范围的流行，发病率达18/10万。 在我国，目前尚无百日咳感染的确切流行病学资料，尽管自1985年中国推行计划免疫，将百白破联合疫苗纳入第一批计划免疫的疫苗，使得百日咳的发病率急剧下降。 但是，由于全细胞百白破联合疫苗易产生的副反应，严重影响了划免疫的实施，使常规免疫的全国覆盖率尚未真正达到85，造成百日咳的局部暴发流行的情况。 如贵州省某镇1997年发生暴发流行，发病率高达20.55(285例/总人口1387)，其中7岁以下儿童占44，此次流行与疫苗接种率低、易感人群累积有关。 浙江丽水报告，1984-1992年百日咳的发病率仍达17.24/10万。 由于百日咳在发病的早期症状不典型，不易诊断，但传染性却很强，所以难以控制传染源和切断传播途径，只有通过预防接种百日咳疫苗，减少易感人群，提高人群对百日咳的免疫水平，形成免疫屏障，才能达到控制和消灭百日咳的目的。 有关流行病学调查证明全细胞百日咳疫苗对于控制百日咳疾病的流行非常有效，免疫人群后可提供中至高水平的保护作用。 英国在1978年和1981年发生了两次因停止接种全细胞百日咳疫苗后最为严重的百日咳流行。 1979年日本由于疫苗接种事故停止接种疫苗，使百日咳发生率大幅度上升。 然而，由于全细胞百日咳疫苗具有复杂的生物学性状，而且有关其效力与毒性之间的关系不甚明了，因此尽管接种全细胞百日咳疫苗后是否会引起脑病已争论了许多年，但是，因接种疫苗引起或诱发严重副反应仍然是一个世界性的问题。 0006与百日咳疫苗接种相关的副反应可以分为两大类。 一类是常见副反应，包括局部和全身轻微副反应，前者如注射局部发生红晕、疼痛、肿胀，在接种百日咳菌体疫苗后的发生率为50；后者如发烧、烦躁、嗜睡、厌食等副反应，吸附无细胞百日咳疫苗、白喉、破伤风类毒素联合疫苗(DTaP)明显比白喉和破伤风类毒素二联疫苗(DT)的副反应高。 另一类为不寻常的副反应，局部的有硬结和化脓，血管神经性水肿等，全身副反应有呕吐、持续哭叫、荨麻疹等，严重的可发生惊厥、虚脱、休克等，极少数人可引起永久性脑损伤。 我国在1988年由中国药品生物制品检定所组织进行了百日咳菌体疫苗人体接种反应观察，体温38.5以上的中强反应6-8h为1.62-10.57，24h为2.5-11.5，48h为0-3.84。 局部中强反应24h为0-4.38，48h为0-3.22，72h为0-2.63。 化脓发生率为0.87。 0007由于百白破疫苗中白喉、破伤风两种类毒素是已经被提纯精制过的有效蛋白抗原，而百日咳则为全细菌体制剂，即包含所有的有效抗原和毒性成分，所以注射百白破疫苗所发生的反应一般为百日咳所含的毒性组分所引起的异常反应，如接种后发生的发烧、红说明书102526717A53/10页6肿、硬结等，并不是疫苗本身所应该具备的性状，而是该疫苗本身含有除了人们所需要的有效抗原成分以外，同时所含的有害成分所引起的异常反应。 而有害成分对于过敏体质或已被某些细菌、病毒隐性感染的接种者较容易引起变态反应。 而有害成分存在量也是疫苗质量的反映。 接种百、白、破疫苗后发生的异常反应还有以下几种严重异常反应0008过敏性合并症1)过敏性休克；2)过敏性皮疹；3)血管神经性水肿；0009神经系统合并症1)脑病；2)神经炎及神经根炎；3)变态性脑脊髓炎。 0010百白破疫苗中的百日咳菌体易诱发潜伏感染，或使原有的疾病加重。 尤其过敏体质和已被某些细菌、病毒隐性感染的接种者容易发生严重异常反应。 但是根据计划免疫的要求，白、破两种类毒素几乎总是与百日咳疫苗合并使用，用于儿童计划免疫，因此菌体百日咳引起的副反应大大干扰了白喉和破伤风类毒素的免疫接种。 有些国家在百日咳发病率大幅度降低的情况下，由于接种疫苗后所引起的上述严重副反应，使人们抵制接受百日咳疫苗，如英国、瑞典和日本等国都一度停止了百日咳疫苗的接种，随后这些国家的百日咳发病率急剧上升。 鉴于此种情况自20世纪70年代起对百日咳杆菌进行了更加深入的研究，研制和纯化了包百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳粘着素等近20种百日咳菌的生物活性成分。 本在研究的基础上，于1981年率先研制成功主要含有百日咳毒素和丝状血凝素无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaine，APV)，并替代百日咳菌体疫苗(whole cell pertussis vaine，WPV)，用于免疫2岁以上儿童，并于1989年开始使用吸附无细胞百日咳疫苗、白喉、破伤风类毒素联合疫苗(adsorbed acellularpertussisvaine，iphtheria toxiod，tetanus toxoidbined vaine；DTaP)，用于3月龄婴儿的基础免疫，至今已累计使用了几千多万针次，使百日咳的发病率重新下降，并且达到历史最低点。 20世纪90年代以来在瑞典、美国、德国、意大利、塞内加尔以及中国等国家，对近20多种不同的DTaP免疫效果、接种反应等进行了临床观察。 结果证明，尽管不同DTaP的免疫保护率有所差异，但DTaP具有与吸附百日咳全细胞疫苗、白喉、破伤风类毒素联合疫苗(adsorbed wholecellpertussisvaine，diphtheriatoxiod，tetanus toxoidbinedvaine；DTwP)同样免疫保护效果。 此外，不论从日本历年累计的接种反应资料，还是其他国家的临观察资料，都证明DTaP的副反应明显低于DTwP23。 目前从世界范围内，各国的百日咳疫苗都处于更新换代的阶段，即新的无细胞百白破疫苗逐步取代传统的菌体百白破疫苗。 至今已有近30个国家批准使用DTaP或正在进行DTaP的临床评估。 目前，欧美、加拿大和日本等国已普遍使用无细胞百日咳疫苗。 我国是于80年代中期开始研制无细胞百白破联合疫苗，90年代中期获得正式生文号。 无细胞百日咳疫苗的生产工艺是沿用日本的无细胞百日咳生产工艺进行生产。 工艺基本上包括大发酵罐培养细菌，硫酸铵沉淀，高盐浓度提取、透析和糖梯度离心等。 由于我国人口众多，每年出生婴儿逾二千万，目前无细胞百白破联合疫苗生产厂家的生产量较低，只有极少数儿童才能使用无细胞百日咳疫苗，因此，从我国的计划免疫预防工作的安全性和与国际接轨的要求来看，我国急需大力生产和发展自己的无细胞百白破联合疫苗，满足每年出生婴儿逾二千万的免疫接种的需要，从而在我国实现以安全、有效的无细胞百白破疫苗全面替代全细菌体百白破疫苗，造福于广大儿童。 0011 2、各国的无细胞百白破联合疫苗的现状00121981年日本的佐藤教授等人在纯化出LPF和FHA两种抗原的基础上，在世界上第一次研制成功了含有两种抗原成分的无细胞百日咳疫苗，并且与白喉和伤风类毒素联合成说明书102526717A64/10页7无细胞百白破联合疫苗。 该疫苗在日本开始正式使用，目前日本已经全部取代了老的菌体百白破疫苗用于儿童计划免疫接种。 1992年美国正式批准使用日本生产的无细胞百日咳疫苗。 中国自80年代开始研制无细胞百日咳疫苗，目前我国已有无细胞百白破联合疫苗正式产品，已经在我国许多省份用于儿童计划免疫，由于该类型疫苗接种反应好于老的百白破疫苗，很受国内欢迎，产品供不应求。 0013目前，无细胞百白破联合疫苗的配方在国际上有所不同，白喉和破伤风类毒素的使用量也不同，成品中的吸附剂含量也有区别，按照含有百日咳抗原的类型主要分为几种1)PT+FHA；2)PT+FHA+Prn；3)PT+FHA+Prn+Agg2，325。 欧洲使用比较多的是第2和第3种。 美国使用的主要是第1和第2种，中使用的是第一种配方，生产工艺是参照日本的无细胞百日咳生产工艺进行生产，我国的无细胞百白破联合疫苗已纳入中国生物制品规程2000版中。 0014 3、吸附无细胞百白破疫苗使用情况00151981年日本率先研制成功含有PT、FHA的无细胞百白破疫苗，到目前日本全国已经全部使用无细胞百、白、破疫苗用于预防百日咳、白喉和破伤风三种严重传染病，日本自1989年起累计使用了3千多万人次。 世界卫生组织自1986年组织在瑞典进行了第一次临床试用无细胞百日咳疫苗起，至今世界上有十多个国家已经使用了该类疫苗。 美国每年从日本进口无细胞百日咳疫苗原液，用于儿童免疫预防百日咳。 亚洲除日本外，印尼、泰国、韩国和台湾地区都从日本进口无细胞百白破疫苗用于免疫接种。 中国许多较发达地区已经开始大范围使用无细胞百白破疫苗，但是由于生产的疫苗数量远远不能满足需要，造成很大的疫苗供应缺口。 发明内容0016要解决的技术问题0017本发明的目的之一是提供一种副反应更小，免疫原性更高，接种更安全，接种人群更广泛的新疫苗及其制备方法。 0018本发明的目的是这样实现的，通过将制备所得到的百日咳原液与精致纯化得到的白喉类毒素和破伤风毒素混合最终制备得到可用于预防百日咳、白喉、破伤风三种疾病的无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述方法采用包括戊二醛解毒步骤的方法来制备包含有效抗原PT和FHA的无细胞百日咳原液，其中戊二醛解毒是将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50gPN/ml，然后加入戊二醛使其最终浓度为0.5，置于20脱毒，每1小时振摇一次，然后加入赖氨酸溶液，使其最终浓度为0.2，置于20作用3小时；采用包括甲醛解毒步骤的方法来制备白喉类毒素和破伤风毒素，其中制备白喉类毒素时甲醛解毒的具体操作条件为选择0.5的甲醛，经调pH至7.07.2，在3739下脱毒，然后加入赖氨酸(9.125)，脱毒42天左右；制备破伤风毒素时甲醛解毒的具体操作条件为甲醛0.15，放置于37温箱中加温脱毒25天。 制备百日咳原液的菌种为百日咳I相菌种58003(CS)，其接种发酵罐培养条件为将配制好SSM培养基加入10L发酵罐，接种细菌的培养浓度为3.0108/ml，培养温度为37，通气量4060L/min，压力0.1kg/cm2，搅拌器的转速设定为350rpm。 制备无细胞百日咳原液的方法还包括硫酸铵盐析、密度梯度离心步骤，其中的硫酸铵盐析是二次盐析，硫酸铵盐析的具体操作条件如下收集培养物并加入低说明书102526717A75/10页8浓度的硫酸铵进行一次盐析，7日后经3500rpm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟，经7000rpm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rpm离心60分钟，收集沉淀加入PBS二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rpm离心，3小时收上清。 制备无细胞百日咳原液的的密度梯度离心是经30000rpm蔗糖密度梯度离心1820小时除去内毒素，收集糖浓度为412之间的样品。 在制备无细胞百日咳原液时，进行戊二醛脱毒后，将所得原液包透析袋，每袋200300ml，置于28，透析7日，进行戊二醛残量检测。 制备得到百日咳原液、白喉类毒素和破伤风毒素后，配置13mg/ml的氢氧化铝，高压灭菌，将氢氧化铝用生理盐水稀释至24mg/ml，将百日咳原液、精制白喉和破伤风类毒素加入氢氧化铝，于20-25搅拌吸附4小时。 0019本发明采用硫酸铵盐析法，再经过蔗糖密度梯度离心，去除内毒素，获得百日咳有效抗原PT和FHA，经过检测这两种有效抗原的纯度完全可以达到国家药典要求的“纯度达到85以上”的标准。 0020 1、选取菌株制备培养基00211.1菌株00221.1.1百日咳I相菌58003(CS)菌株中国药品生物制品检定所00231.1.2白喉棒状杆菌菌株(PW8)菌株中国药品生物制品检定所00241.1.3破伤风厌氧芽孢杆菌菌株(L58)菌株中国药品生物制品检定所00251.2培养基00261.2.1包-姜氏培养基00271.2.2改良林氏培养基00281.2.3半固体碎肉培养基00291.2.4综合培养基和半综合培养基00301.2.5改良马丁培养基和牛肉消化的林氏培养基00311.2.6双胨培养基0032上述培养基均由公司培养基组提供00331.3试剂00341.3.1百日咳I相标准血清(93-1)中国药品生物制品检定所00351.3.2百日咳分型血清 1、 2、3型(84-1)中国药品生物制品检定所0036所用化学试剂均为分析纯，0037 2、菌种库的建立及鉴定00382. 1、百日咳菌种库的建立及检定0039将原始种子批的冻干菌种启开后接种于包-姜氏(含25羊血)培养基上，于3537，培养不超过72小时，以后各代不超过48小时，传至第4代，培养24小时，刮下菌苔，于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20保存，为主代种子批菌种。 0040主代种子批菌种检定启开1支主代种子批菌种，于改良B-G固体培养基上，37培养72小时，检查菌落生长情况为光滑凸起，灰白色不透明露滴状小菌落，菌落周围有不清晰溶血环。 传3代，37培养48小时，菌苔生长不透明，灰白色，光滑，湿润；刮取菌苔，进行以下检定说明书102526717A86/10页900412.1.1菌落形态为光滑凸起，灰白色不透明露滴状小菌落，菌落周围有不清晰溶血环。 00422.1.2革兰氏染色革兰氏阴性短小卵圆形杆菌。 00432.1.3血清学特性标准诊断血清购自中国药品生物制品检定所。 0044试管凝集试验百日咳I相标准血清批号93-1；刮取菌苔，用比浊法测定菌液浓度，并用0.85NaCl溶液稀释至30亿/ml。 血清稀释度200、400、800、1600、3200、6400、12800，每管加入以上稀释度血清0.5ml，加菌液(30亿/ml)0.5ml，使之实际血清稀释度为400、800、1600、3200、6400、12800，混匀，置3过夜，再静置室温2小时，判断凝集效。 0045玻片凝集试验标准分型因子血清批号84-1( 1、 2、3型)，将标准分型血清分别与刮下的菌苔进行玻片凝集试验。 00462.1.4生化检定0047各管加菌液(60亿/ml)0.5ml，混匀后置35-37培养7日，00482.1.5皮肤坏死试验0049用在37培养48小时的菌苔混悬液稀释，豚鼠皮内注射0.1ml，观察72小时，记录出血性坏死部位，用“+”表示。 00502.1.6菌种毒力试验0051用体重1618g之小鼠随即分为3组，每组免疫10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培养2028小时以PBS稀释的菌液0.05mL，观察14天，记录小鼠生死情况，按ReedMuench法计算LD50，00522.1.7免疫效力试验0053分别用标准品和待检品的不同稀释度免疫小鼠(8只/组)，每只小鼠腹腔注射0.5ml。 免疫14天后，每只小鼠脑内攻击0.03ml含8万个菌的菌液 (18323)；同时进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小鼠。 攻毒后，记录小鼠14天内死亡情况，计算出对照组LD50；并计算待检菌种的IU值。 00542. 2、白喉棒状杆菌菌种库的建立及检定0055将冻干的原始白喉棒状杆菌菌种 (38007)启开后，接种于改良林氏培养基中管，34培养2448小时，再传代于改良林氏培养基中管中，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20保存，为主代种子批菌种。 0056白喉棒状杆菌菌种检定将冻干的主代种子批白喉棒状杆菌菌种 (38007)启开后，接种于改良林氏培养基中管，34培养2448小时，按照中国生物制品规程2000版中白喉菌种的检定方法和质量标准，对冻干的白喉棒状杆菌的主代种子批进行以下菌种检定。 00572.2.1培养及形态特性0058将培养好的白喉棒状杆菌分别接种于以下三种不同的培养基上，进行细菌培养特性的检查。 0059方法和判定0060吕氏斜面培养菌苔呈灰白色，表面光滑突起；菌落圆形，边缘整齐。 0061亚碲酸钾平板培养菌落呈灰黑色具金属光泽。 说明书102526717A97/10页100062血琼脂平板培养菌落呈灰白色，不透明，不产生溶血素。 00632.2.2镜检及染色特性0064方法和判定0065将培养好的白喉棒状杆菌进行革兰氏染色，显微镜观察为深紫色，说明革兰氏染色阳性，并且具有异染颗粒，杆状的菌体呈一端或两端膨大，菌体排列呈栅栏、X或Y。 00662.2.3生化特性0067将菌液接种于各生化培养基中，3537培养7日。 00682.2.4特异性中和反应0069将接种于改良林氏培养基中管，34培养2448小时的白喉主代种子批的细菌接种于吕氏培养基上，进行毒力测定。 0070方法和判定0071Elek平板毒力试验用浓度为1000Lf/ml的白喉抗毒素制成抗毒素滤纸条，平整铺于Elek琼脂培养基或适宜的白喉产毒培养基的双碟上，倒置双碟约1小时。 用白金接种环挑取吕氏培养物，与滤纸垂直划线接种。 置于37孵箱，培养4872小时，观察菌种生长边缘是否有白色沉淀线。 00722. 3、破伤风芽孢杆菌菌种库的建立及检定0073将冻干的原始破伤风厌氧芽孢杆菌菌株(L58)菌种启开后，接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34孵箱，培养48小时，连续传4代，离心后将菌体放置于脱脂牛奶内混匀，分装后冷冻干燥，真空封口，-20保存，为主代种子批菌种。 将破伤风厌氧芽孢杆菌菌株(L58)主代种子批菌种启开后，接种于半固体碎肉培养基中管，放置于34培养48小时，收集菌体，用于以下菌种检定内容。 00742.3.1培养及形态特性由于破伤风是专性厌氧杆菌，将培养好的破伤风杆菌接种于不同培养基中进行培养基形态特征检测。 0075方法和判定0076在庖肉培养基中培养肉汤呈浑浊，产生气体，具腐败性恶臭。 0077血琼脂平板培养菌落呈弥漫生长。 0078半固体培养基经48-72小时培养，穿刺线呈毛刷样生长，表现菌体鞭毛动力。 00792.3.2镜检及染色特性0080方法和判定0081将破伤风杆菌的初期培养菌体进行革兰氏染色，在显微镜下观察，革兰氏染色呈阳性，少见芽孢。 培养48小时以后，可见芽孢，菌体呈鼓槌状，芽孢位于顶端为正圆形。 00822.3.3生化特性0083将菌液接种于各生化培养基中，3537培养7日，00842.3.4产毒试验0085方法和判定0086破伤风杆菌经液体产毒培养基培养，过滤取培养液注射至少4只体重1822g小鼠，每只小鼠尾根部皮下注射0.1ml，于注射后1224小时观察小鼠，出现尾部僵直竖起、后退强直痉挛或全身肌肉痉挛等症状。 00872.3.5特异性中和反应说明书102526717A108/10页110088方法和判定0089取适量产毒培养滤液与相应稀释的破伤风抗毒素经体外中和后，注射4只体重18-22g小鼠，同时设立不结合破伤风抗毒素的培养滤液注射小鼠，作为阳性对照。 注射后每日观察，阳性对照出现明显破伤风症状并死亡，试验组小鼠存活。 附图说明0090图1为吸附无细胞百白破联合疫苗成品生产工艺流程图。 具体实施方式0091例1无细胞百日咳原液、精制白喉和破伤风类毒素的制备00921. 1、无细胞百日咳原液的制备00931.1.1百日咳I相菌种58003(CS)接种与BG血培养基大管培养34代0094培养时间选择3844小时，控制pH值8.5左右时，百日咳杆菌的菌体浓度和血凝活性较高。 00951.1.2接种发酵罐培养0096将配制好SSM培养基加入10L发酵罐，接种细菌的培养浓度为3.0108/ml，培养温度为37，通气量4060L/min，压力0.1kg/cm2，搅拌器的转速设定为350rpm。 培养至26个时开始测量发酵液的pH，浓度，血凝，每隔3h取样测量以上参数，共检测发酵时间为50小时。 00971.1.3硫酸铵盐析0098收集培养物并加入低浓度的硫酸铵进行一次盐析、7日后经3500rPm离心40分钟，弃上清，沉淀中加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)进行一次浸提，每天搅拌2次，每次40分钟。 经7000rPm离心60分钟弃沉淀、上清液中加高浓度的硫酸铵二次盐析、经9000rPm离心60分钟，收集沉淀加入PBS(0.05MPB、1MNaCl、0.1g/L硫柳汞、pH8.0)二次浸提3天，每天搅拌2次，每次1小时，包袋透析，铵根检测合格后，透析内液经16000rPm离心3小时收上清。 00991.1.4密度梯度离心0100经30000rpm蔗糖密度梯度离心1820小时除去内毒素，收集糖浓度为412之间的样品。 其中含有PT和FHA组分。 01011.1.5戊二醛脱毒0102戊二醛解毒的浓度为，在222的温度下解毒时间4小时。 0103将梯度离心后的中间品用PBS稀释为50gPN/ml，然后加入戊二醛使之最终戊二醛浓度为0.5，置于20脱毒。 每1小时振摇一次。 然后加入赖氨酸溶液，使之最终浓度为0.2，置于20作用3小时。 01041.1.6无细胞百日咳原液0105包透析袋，每袋200300ml，置于28。 透析7日，进行戊二醛残量检测。 合格后可收液，否则继续透析，透析过程每日换透析液2次。 01061.1.7检测及肯定的检测结果0107经检测可以确定上述制备方法最终制备得到的产品中包含目标抗原PT和FHA，且说明书102526717A119/10页12含量达到相应的要求。 01081.2精制白喉类毒素的制备01091.2.1菌种培养0110采用改良的林氏液体培养基，采用静止培养和深层培养两种培养方式。 深层培养方式可以补加氨基酸，调整pH，通过搅拌和控制通氧量及温度，使得产毒水平大幅度增加。 0111a)大规模生产细菌时发酵温度控制在2435；0112b)pH的变化控制为开始发酵时pH为7.88.2，以后随着培养时间会逐步下降，约12小时以后，pH会从8.0逐步降到7.0，然后再逐步回升到8.0，通过补入适当的糖加以控制pH，在这种条件下说明细菌生长茂盛，产毒较好。 如果pH不断下降，说明细菌生长不佳。 0113c)根据培养条件补充碳源和氮源，麦芽糖作为碳源，在pH发生变化时进行适当的补充。 在白喉杆菌深层培养时，当氨基氮从1.41.6mg/ml下降到0.40.7mg/ml时，补充谷氨酸钠，胱氨酸及生长因子可使产毒单位从150Lf/ml提高到400Lf/ml。 控制培养时间在4550小时之间，这时的白喉毒素的Lf/ml产量基本保持稳定，并且pH值也基本恒定在8.0左右的生产条件下较为合适。 01141.2.2上清硫酸铵盐析0115采用硫酸铵分段沉淀法，第一段加入硫酸铵24-27(w/v)，过滤后收集滤液，第二段加入硫酸铵15-18(w/v)，过滤后收集沉淀。 经过透析去除-NH4离子，再经过除菌过滤，获得大于1500Lf/ml的精制白喉类毒素。 01161.2.3脱毒0117我们采用的解毒方式是首先将生产的精制毒素，毒素浓度过大，不宜解毒完善，精制后的毒素经适当稀释至浓度为40Lf/ml左右时，再进行解毒，解毒效果较完全，毒性不易发生逆转。 然后再进行解毒的工艺，这样可以减少所生产的毒素损失。 精制毒素的解毒选择了0.5的甲醛浓度，经调pH至7.07.2，在3739下脱毒，经一步脱毒和两步的加深脱毒试验的比较，采用加入赖氨酸(9.125)，脱毒42天左右，控制了毒性逆转现象，并且能有效的保持抗原性。 01181.2.4除菌过滤