CN102894467A利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法

CN102894467A利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法 (10)申请公布号102894467A (43)申请公布日xx.01.30102894467A*102894467A* (21)申请号xx10399941.8 (22)申请日xx.10.19A24B15/20(xx.01) (71)申请人云南瑞升烟草技术（集团）有限公司地址650106云南省昆明市高新开发区海源北路1699号 (72)发明人毕薇李仙刘煜宇刘丽芬 (74)专利代理机构昆明大百科专利事务所53106代理人李云 (54)发明名称利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法 (57)摘要利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，是用固定化酶制剂处理烟草提取物原料获得处理产物，再用醋酸菌发酵处理产物获得发酵产物，然后将发酵产物浓缩处理，即得烟草提取物。 本发明可以快速有效地降低烟草提取物中淀粉、蛋白质、纤维素、木质素及果胶质的含量并适度提高烟草提取物的酸度，有效提高卷烟的香味和抽吸舒适感，提升烟草提取物的使用范围。 (51)Int.Cl.权利要求书1页说明书4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页1/1页21.利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，其特征在于，方法如下固定化酶制剂处理烟草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木质素酶、果胶酶、漆酶、酯酶中的一种或多种制成酶液待用；将载体用磷酸盐缓冲液浸泡0.5-6h后取出，作为酶制剂的固定化载体，再将此载体放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后将载体从酶液中取出即得到固定化酶；将烟草提取物原料加入2-5倍水灭菌后与固定化酶混匀，所加入的固定化酶与烟草提取物原料的质量比控制在0.05-10%，混匀后在20-45渥堆处理24-120h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入5-20倍水后接入醋酸菌种子液，接入的醋酸菌种子液与处理产物的质量比控制在0.5-10%，25-38培养24-120h获得发酵产物；浓缩将发酵产物浓缩处理，即得烟草提取物。 2.根据权利要求1所述的利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，其特征在于，制备酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木质素酶、果胶酶、漆酶、酯酶中的一种或多种与水混合配制。 3.根据权利要求2所述的利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，其特征在于，配制酶液时按质量比加入稳定剂0.2-10%和/或防腐剂0.01-2%，余量为水。 4.根据权利要求1所述的利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，其特征在于，所述烟草提取物原料是指烟叶、烟叶碎片、烟末、碎烟梗中的一种或几种。 5.根据权利要求1或2或3或4所述的利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，其特征在于，用于制备固定化酶制剂的载体是表面具有微小孔隙的纸样载体，所述纸样载体为空气玻纤滤材、醋酸纤维、滤纸、宣纸、石棉纸中的任意一种，孔隙直径在1-500m，将载体剪成直径在0.3-3cm的圆形纸片。 权利要求书102894467A21/4页3利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法技术领域0001本发明涉及烟用香料制备方法技术领域。 背景技术0002在烟草制品中，特别注重烟草香气和吸味，常以添加一些烟草提取物作为提升抽吸品质、完善产品风格特征的手段。 然而，由于烟草提取物的原料通常是一些低次烟叶或烟草废弃物，从而导致提取物在卷烟应用方面存在青杂气浓重、刺激性较高、烟草本香不突出等问题，制约了烟草提取物在卷烟制品中的运用。 0003淀粉、蛋白质、纤维素、木质素及果胶质是一些会带来不良抽吸效果的大分子物质。 目前，国内外降低卷烟原料中这些物质的方法主要通过在烟叶发酵陈化阶段施加微生物和酶制剂等，所需时间较长，效果较为单一。 对于烟草提取物来说，酸性物质的存在能在一定程度上提高其抽吸口感，增加与烟丝的匹配度，调节卷烟的协调性，使整体韵调和谐。 然而，目前还没有一种较好的方法能在快速降低淀粉、蛋白质、纤维素、木质素、果胶质等的同时还可适度增加烟草提取物的酸度。 0004酶的固定化技术是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。 利用酶的固定化技术进行酶解，相比较常规酶解，酶活力损失较少，能显著提高酶的稳定性和酶解效率。 关于酶的固定化技术，专利xx10026535.1提出了一种采用醋酸纤维固定化复合酶技术对富营养化水污染治理的专用固定化复合酶配方；专利xx10041643.X提出了一种采用固定化酶生产毛蕊花糖苷的方法；马宁等（马宁,谢文磊.磁性高分子微球固定化酶的制备及应用方法J.现代化工.xx,6:364-366.）提出了磁性高分子微球固定化酶的制备及应用方法；这些专利或文章都没有涉及到利用固定化酶制备烟草提取物，且所述的固定化酶制剂的制备较为复杂，与烟草提取物的兼容性较差。 0005醋酸菌是一类能使糖类和酒精氧化成醋酸等产物的细菌。 工业上可以利用醋酸菌酿醋、制做醋酸和葡萄糖酸等，也可利用醋酸菌进行发酵产酸，通过调节醋酸菌的培养条件和发酵底物，获得适宜的发酵产品。 关于醋酸菌的专利较多，但都集中在食醋、酒等酿造领域；专利xx10130665.0提出一种发酵型烟用罗汉果浸膏的制备方法，其中提到利用醋酸菌发酵罗汉果浸膏后作为烟用添加剂使用；但这些专利和文章都没有提到在烟草提取物中直接利用醋酸菌进行发酵的工艺。 发明内容0006本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种利用纸样载体固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，以快速有效地降低烟草提取物中淀粉、蛋白质、纤维素、木质素及果胶质的含量并适度提高烟草提取物的酸度，有效提高卷烟的香味和抽吸舒适感，提升烟草提取物的使用范围。 0007本发明的目的通过以下技术方案予以实现说明书102894467A32/4页4利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，方法如下固定化酶制剂处理烟草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木质素酶、果胶酶、漆酶、酯酶中的一种或多种制成酶液待用；将纸样载体用磷酸盐缓冲液浸泡0.5-6h后取出，作为酶制剂的固定化载体，再将此载体放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后将载体从酶液中取出即得到固定化酶；将烟草提取物原料加入2-5倍水灭菌后与固定化酶混匀，所加入的固定化酶与烟草提取物原料的质量比控制在0.05-10%，混匀后在20-45渥堆处理24-120h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入5-20倍水后接入醋酸菌种子液，接入的醋酸菌种子液与处理产物的质量比控制在0.5-10%，25-38培养24-120h获得发酵产物；浓缩将发酵产物浓缩处理，即得烟草提取物。 0008本发明制备酶液是采用淀粉酶、蛋白酶、木质素酶、果胶酶、漆酶、酯酶中的一种或多种与水混合配制。 配制酶液时可按质量比加入稳定剂0.2-10%和/或防腐剂0.01-2%，余量为水。 所述烟草提取物原料是指烟叶、烟叶碎片、烟末、碎烟梗中的一种或几种。 本发明用于制备固定化酶制剂的载体是表面具有微小孔隙的纸样载体，所述纸样载体为空气玻纤滤材、醋酸纤维、滤纸、宣纸、石棉纸中的任意一种，孔隙直径在1-500m，将载体剪成直径在0.3-3cm的圆形纸片。 本发明所述固定化酶制剂制备后综合酶活为2-80U/cm2，这样的酶活力，能够保持渥堆状态下处理烟草提取物原料中淀粉、蛋白质、木质素和果胶质的能力，且渥堆处理的方式为酶发挥最佳处理能力创造了极佳的少氧环境并保持了适宜的温度，更相似于烟叶自然陈化发酵的条件，但与之相比大大缩短了时间。 0009本发明所述用于发酵烟草提取物的醋酸菌属于常见的酿造食醋的醋酸杆菌，其产酸能力较强，能够在较短时间内利用烟草原料产生一定量的醋酸，所产生的醋酸创造了微弱的酸性环境，为烟草提取物提升了香气质、提高了香气量，扩大了运用范围。 0010利用纸样载体将酶进行固定化后制成固定化酶制剂，用于快速酶解烟草提取物原料中的淀粉、蛋白质、纤维素、木质素及果胶质等大分子物质，之后结合醋酸菌发酵产酸，能在较短时间内既降低原料中一些会带来不良抽吸效果的大分子物质含量，又产生了能提高抽吸舒适度的酸性物质。 具体实施方式0011为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数据，对本发明做进一步详细说明。 所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 0012利用固定化酶制剂结合醋酸菌发酵制备烟草提取物的方法，方法如下固定化酶制剂处理烟草提取物原料用淀粉酶、蛋白酶、木质素酶、果胶酶、漆酶、酯酶中的一种或多种制成酶液待用；将纸样载体用磷酸盐缓冲液浸泡0.5-6h后取出，作为酶制剂的固定化载体，再将此载体放入酶液中，20-45浸泡0.5-6h后将载体从酶液中取出即得到固定化酶；将烟草提取物原料加入2-5倍水灭菌后与固定化酶混匀，所加入的固定化酶与加水灭菌后的烟草提取物原料的质量比控制在0.05-10%，混匀后在20-45渥堆处说明书102894467A43/4页5理24-120h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入5-20倍水后接入醋酸菌种子液，接入的醋酸菌种子液与处理产物的质量比控制在0.5-10%，25-38培养24-120h获得发酵产物；浓缩将发酵产物浓缩处理，即得烟草提取物。 0013实施例1固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用25%淀粉酶、0.2%酶稳定剂、0.01%防腐剂和余量的水制成酶液；将空气玻纤滤材剪成3cm的圆形纸片放入pH7.5磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h后取出，再放入酶液中20浸泡6h制成固定化酶制剂；将200g津巴布韦烟叶碎片加入5倍水灭菌后接入1g固定化酶制剂，混匀后35渥堆处理60h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入20倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为10%，25培养120h获得发酵产物；浓缩发酵产物至密度为1.3即得烟草提取物。 0014实施例2固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用将30%蛋白酶、5%酶稳定剂和余量的水制成酶液；将滤纸剪成0.3cm的圆形纸片放入pH7.0磷酸盐缓冲液中浸泡6h后取出，再放入酶液中35浸泡0.5h制成固定化酶制剂；将200g土耳其香料烟烟末加入2倍水灭菌后接入0.1g固定化酶制剂，混匀后45渥堆处理120h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入10倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为0.5%，38培养24h获得发酵产物；浓缩发酵产物至密度为1.5即得烟草提取物。 0015实施例3固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用10%木质素酶、2%防腐剂和余量的水制成酶液；将石棉纸剪成1.5cm的圆形纸片放入pH6.5磷酸盐缓冲液中浸泡3h后取出，再放入酶液中30浸泡4h制成固定化酶制剂；将200g巴西粉碎烟梗加入3倍水灭菌后接入6.5g固定化酶制剂，混匀后37渥堆处理24h获得处理产物。 0016醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入5倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为5%，30培养60h获得发酵产物；浓缩发酵产物至密度为1.2即得烟草提取物。 0017实施例4固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用15%果胶酶、1.0%酶稳定剂、1.0%防腐剂和余量的水制成酶液；将宣纸剪成0.5cm的圆形纸片放入pH6.5磷酸盐缓冲液中浸泡2h后取出，再放入酶液中40浸泡5h制成固定化酶制剂；将200g红花大金元烟叶碎片加入4倍水灭菌后接入2.5g固定化酶制剂，混匀后45渥堆处理24h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将处理产物加入5倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为5%，35培养40h获得发酵产物；浓缩发酵产物至密度为1.3即得烟草提取物。 0018实施例5说明书102894467A54/4页6固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用5%漆酶和余量的水制成酶液；将醋酸纤维剪成1.0cm的圆形纸片放入pH6.5磷酸盐缓冲液中浸泡1.5h后取出，再放入酶液中45浸泡1.5h制成固定化酶制剂；将200g K326烟末加入3倍水灭菌后接入20g固定化酶制剂，混匀后20渥堆处理24h获得处理产物；醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入3.5倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为3%，25培养80h获得发酵产物即发酵液；浓缩发酵液至密度为1.1即得烟草提取物。 0019实施例6固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用3%酯酶和余量的水制成酶液；将石棉纸剪成2.0cm的圆形纸片放入pH6.5磷酸盐缓冲液中浸泡5h后取出，再放入酶液中30浸泡0.5h制成固定化酶制剂；将200g云烟87粉碎烟梗加入2倍水灭菌后接入5g固定化酶制剂，混匀后37渥堆处理36h获得处理产物。 0020醋酸菌发酵培养醋酸菌种子液待用；将获得的处理产物加入10倍水后接入醋酸菌种子液，醋酸菌种子液与处理产物的质量比为3.5%，36培养30h获得发酵液；浓缩发酵液至密度为1.2即得烟草提取物。 0021实施例7固定化酶制剂处理烟草提取物原料按质量比用10%淀粉