实验一培养基的配制与灭菌.doc

实验一培养基的配制与灭菌一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一） 培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供 不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用 类别成分作用无机物大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S微量元素：Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、I、Co等植物生长必需的营养元素有机物营养物：糖类、氨基酸及酰胺类生理活性物：维生素等为植物细胞提供C、H、O、N等必要元素作为生理活性物质在细胞代谢中起一定作用植物生长调节剂植物天然的五类激素及其人工合成的类似物作为生理活性物质参与植物生长发育的调节附加物如琼脂、活性碳等有利于植物细胞生长其他未知复合成分如椰子汁、酵母提取物、香蕉、西瓜水、马蹄汁等供给一些必要的微量营养成分、生理活性物和生长激素等配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。一般要配下列母液：1、 微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成10002、有机化合物母液：通常配成1003、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。浓度为10004、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。5、10大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。 (二) 培养基的灭菌： 培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。灭菌方法下列几种：1 高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1kg/cm2)的压力下持续约20分钟。2、 过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22m(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。3. 60Co射线法：用射线过量照射以灭菌。可用于大量灭菌，但设备昂贵。三、仪器设备及用具(一) 仪器设备万分之一电子天平 百分之一电子天平 超净工作台 高压锅 酸度计 磁力搅拌器及搅拌子 不锈钢过滤器 玻璃蒸馏水器 家用冰箱(二) 用具烧杯：100ml1， 500ml1 ； 量筒：100ml1， 250ml1 磨口试剂瓶：100ml1， 500ml1；带盖试剂瓶：500ml2三角瓶： 100 ml1，250 ml1药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干(三) 试剂1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯） 琼脂粉N6大量：KNO3 CaCl22H2O MgSO47H2O KH2P O4 (NH4)2SO4B5微量：KI H3BO3 MnO4H2O ZnSO47H2O Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCL26H2O Na2EDTA FeSO47H2OB5有机：盐酸硫胺素 盐酸吡哆醇 烟酸 肌醇 谷氨酰胺 水解酪蛋白 脯氨酸 2、4D 6-BA NAA五、实验步骤（一）配母液1、 B5微量元素母液（1000/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。用量极少的成分(如CuSO45H2O、CoCL26H2O、Na2MoO42H2O)即使按1000倍称量仍很困难。2、 N6大量元素母液（10）、B5有机成分母液（100）：配法同1。3、 2，4-D母液(0.5mg/ml)：用万分之一天平称取2，4-D 50mg用少量95%乙醇溶解加水定溶为100ml.4、 6-BA母液（1mg/m l)：用万分之一天平称取6-BA 100mg用少量1N盐酸溶解加水定溶为100ml.5、 NAA母液（1mg/m l)：用万分之一天平称取NAA 100mg用少量95%乙醇溶解加水定溶为100ml.6、 铁盐母液（1000/1000ml）：用百分之一天平称取FeSO47H2O 27.8g， Na2EDTA 37.3g分别置于1000ml和500ml烧怀，各加水500ml加热搅拌，充分溶解趁热混合，冷却装瓶。以上各母液配好后分别装入磨口试剂瓶，贴上标签，写明名称、浓度和配制日期，置于4冰箱保存。（二）配NB诱导、分化培养基1、诱导培养基（本次配置）N6大量+B5微量+B5有机+30g/L蔗糖+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+300mg/L水解酪蛋白+2mg/L 2,4-D+8.0g/L 琼脂粉pH5.82、分化培养基（本次实验3周后再配置）N6大量+B5微量+B5有机+30g/L蔗糖+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+1.25mg/LCuSO45H2O+300mg/L水解酪蛋白+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA +8.0g/L 琼脂粉pH5.8每小组诱导培养基、分化培养基各配400ml，按比例加入各成分充分搅拌溶解 加水定容为200 ml 调pH至5.8加入琼脂粉用牛皮纸包好瓶口 灭菌倒平板或三角瓶 （三）高温高压灭菌高压锅内加水将待灭菌物品放入锅内，盖好，打开排气阀和安全阀通电水沸后排气10分钟关上两阀，压力升至108KPa(1.1kg/cm2) 开始计时，维持此压力20分钟断电压力表降至0后，打开气阀放气，开盖，取出灭菌好的物品，放入培养室，倒平板。六、注意事项1、配制培养基必须用无离子水或玻璃器蒸馏水，化学药品必须是高纯度的。2、配培养基时，必须按顺序称取，