猪支原体肺炎灭活疫苗.doc

猪支原体肺炎灭活疫苗（P-5722-3株）本品系用猪肺炎支原体P-5722-3株（NL1042株）接种适宜培养基培养，收获培养物，经BEI灭活后，与矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防猪支原体肺炎。 处方 制法 性状乳白色乳剂。 鉴别 检查 含量测定 功能与主治/作用与用途 用法与用量/用法与判定 注意事项 规格（1）50头份（100ml）/瓶 （2）250头份（500ml）/瓶 （3）500头份（1000ml）/瓶 贮藏28保存，有效期为24个月。 制剂 附注：猪支原体肺炎灭活疫苗效力检验方法采用固相ELISA法测定疫苗中所含抗原的相对效力单位。 1 材料 1.1 设备 1.1.1 96孔微量反应板 1.1.2 酶联读数仪 1.1.3 超声波裂解器 1.1.4 离心机 1.1.5 1489mm离心管 1.1.6 2589mm离心管 1.1.7 加样器及配套吸头 1.1.8 酶联洗板机 1.1.9 温箱 1.1.10 pH计 1.1.11 混合器 1.1.12 试剂贮存管 1.1.13 微量板震荡器 1.1.14 RELPOT软件包（3.1或更新版本） 1.1.15 吸水纸 1.2 缓冲液 1.2.1 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）氯化钠 8.0g 氯化钾 0.2g 磷酸二氢钾 0.2g 磷酸氢二钠 1.15g 纯水 加至 1 L 将各种盐按比例溶解于水中，调至pH 7.2 0.1。在室温下保存，如不打开，可使用6个月，打开后，可使用3个月。 1.2.2 PBS-吐温20 （PBST） 取0.5ml吐温20，加到1L PBS中。在室温下保存，如不打开，可使用6个月，打开后，可使用3个月。 1.2.3 1% PVA/PBS 取10g聚乙烯醇（PVA，88%水解物），加到1L PBS中，稍加热，使其溶解。滤过。在室温下保存，可使用3个月。 1.3 试剂 1.3.1 猪肺炎支原体单克隆抗体 Norden杂交瘤1-2腹水单抗。在-10-25下保存。经Western Blot试验证实，该单抗识别猪肺炎支原体上的 40kD蛋白质。 1.3.2 参考疫苗 1.3.3 阴性对照品 含5% Amphigen的生理盐水乳剂。在-65下保存。 1.3.4 阳性对照品 1.3.5 酶结合物 通过亲和层析方法纯化的羊抗鼠IgG（H+L）过氧化物酶结合物，每瓶1.0mg。冻干的酶结合物在28下保存，使用时，用1% PVA/PBS稀释至终浓度为0.5mg/ml。稀释后的酶结合物在-10-25下可保存1年。 1.3.6 底物 ABTS。 2 待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品、阴性对照品的处理 2.1 将各种样品（待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品） 至少14ml在 65以下冷冻至少24小时。 2.2 将待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品在37 2下融化20分钟。 2.3 将上述样品分别分成2等份（各7ml），分别加入离心管中，超声处理5565秒 （脉冲，50%功率循环，输出功率=4），并用循环水进行冷却。 2.4 将上述每种超声处理过的样品混合，分别倒入超速离心管中（每种样品约12.012.5ml），在28下以30000r/min离心 6小时。 2.5 离心后，小心弃去油层和上清液，用Kimwipe对离心管进行干燥，直到除去离心管内壁上残留的油层。分别将待检疫苗、参考疫苗、阳性对照品和阴性对照品的离心沉淀物溶解在1.2ml PBS中，用封口膜封口，置28过夜。 2.6 次日，通过振动和反复吹吸使猪肺炎支原体细胞沉淀物充分溶解。 3 抗原包被 3.1 抗原稀释 3.1.1 参考疫苗抗原 进行2倍系列稀释，直至1:128。 3.1.2 待检疫苗抗原和阳性对照品 稀释到参考疫苗工作曲线范围内。 3.1.3 阴性对照品 稀释至1:16（取62.5ul阴性对照品样品加到937.5ul PBS中）。 3.1.4 空白对照 PBS。 3.2 包被 取一96孔板，每份抗原一式3孔，每孔加100ul。加盖，置37 2 6065分钟。用PBS手动洗涤一次。 4 封闭 每孔中各加入1% PVA/PBS 250ul，加盖，置37 2 3035分钟，倒去液体，拍干。 5 加入指示抗体 用1% PVA/PBS将腹水单抗稀释成1:1000，每孔加100ul，加盖，置37 2 6065分钟。用PBST洗板3次。 6 加入酶标抗体 用1% PVA/PBS将羊抗鼠IgG（H+L）过氧化物酶结合物稀释成1:4500，每孔加入刚稀释好的酶标抗体溶液100ul，加盖，置37 2 6065分钟。用PBST洗板3次。 7 加入底物 每孔中加入新制备的ABTS 100ul，加盖，置室温下30分钟。振荡反应板后，在酶联读数仪上读取波长405nm下的OD值。 8 数据处理 用RELPOT软件包（3.1或更新版本）进行数据处理。 8.1 将最小OD值设置为0.05，将最小斜度设置为0.15，将超出这些范围的数据自动剔除。 8.2 将每孔OD值减去空白孔OD值的平均值。 8.3 输入参考疫苗校正后的OD值和稀释度。 8.4 输入阳性对照品和待检疫苗校正后的OD值和稀释度。 8.5 将输入的数据进行处理，并打印结果。 8.6 根据打印结果中的最高数值选择阳性对照品和待检疫苗的最高RP值。 9 结果判定 每批疫苗出厂时的RP值应不低于6.33，在整个有效期内的RP值应不低于5.06。 9.1 无结果是指：缺乏有效的参考疫苗或其他样品的线（在有效的参考疫苗或样品线中，每个参考疫苗应至少有3个点，每个阳性对照品或待检疫苗应至少有3个点）；阴性对照品的OD 值大于参考疫苗的最小OD值；根据有效的平行线得到的对照样品的效力，超出了2个标准差范围。如发生上述情况，可以重检至多2次。如在某批产品的检验过程中，由于相同原因出现3次无结果，则应停止对该批疫苗的检验，直到查清原因并使问题得到解决为止。在问题得到解决后，可对该批产品进行重检。 9.2 结果可疑是指：可以获得有效的参考疫苗线和待检疫苗线，但二者不平行。由于不能确定产品的效力是否合格，因此该批产品不能出厂。如果第1次检验结果为结果可疑，可以重检3次。根据表1中的