第十一章 蛋白质的相互作用（Protein-Protein Interactions）.doc

Proteomics Chapter 11 Protein-Protein Interactions第十一章 蛋白质的相互作用(Protein-Protein Interactions)1. 概况随着人类基因组测序工作的完成，生命科学进入到后基因组和蛋白组的时代。因此，蛋白质的相互作用研究就显得越来越重要。生命活动过程与蛋白质的相互作用是密不可分的，如DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、细胞周期调控、信号转导等重要的生命过程均涉及到蛋白质复合体的作用。下面以Wnt信号通路为例对此加以说明。Wnt信号通路是一条保守性很强的信号通路，该通路调节控制许多的生命过程，如细胞形态与功能的分化及维持、免疫、应激、细胞癌变与凋亡等等。Wnt信号通路的作用分子包括：Wnt蛋白家族成员、卷曲 (frizzled) 蛋白、Dishevelled蛋白、-联蛋白(-catenin)、轴蛋白(axin)、结肠癌抑制因子(APC)、糖原合酶激酶(GSK3)、-TrCP蛋白、淋巴增强因子 (LEF)/T细胞因子 (TCF) 等。当没有Wnt信号时，GSK3、APC、axin组成破坏复合体，使-联蛋白被磷酸化，最终泛肽化而降解。细胞核内，转录抑制因子Groucho家族成员与转录因子TCF形成复合物，通过HMG框结合在靶基因上，抑制靶基因的转录。当有Wnt信号传入时，通路中的下游分子Dsh抑制了破坏复合体的作用，-联蛋白在胞质中积累进入核内，TCF与入核的-联蛋白结合，导致其与Groucho的结合下降，从而去除抑制作用，激活了靶基因的转录。从上面可以看出，蛋白质的相互作用包括三个方面： 多亚基蛋白质的形成：即分离纯化后可形成两个或多个不同蛋白质，如血红素、色氨酸合成酶、大肠杆菌DNA合成复合酶等。 多成分的蛋白质相互作用，如核孔复合体、剪接体、纺锤体等。 瞬时的蛋白质相互作用，控制着一些重要的生命活动。所有的蛋白质修饰过程都需要这类相互作用。这类相互作用几乎参与调节细胞内基本生命活动的所有形式，如细胞生长、细胞周期、代谢途径、信号转导等。除了蛋白质修饰以外，其他过程如转录复合体与特定启动子的结合、蛋白质的跨膜运输、新生肽链的折叠、也包含了瞬时的蛋白质相互作用。2. 蛋白质相互作用的研究策略与方法2.1生化方法2.1.1蛋白质亲和层析 方法在一定的条件下，某种蛋白质可以共价连接在基质如琼脂糖 (Sepharose) 上，用以结合抽提物中能与该种蛋白质结合的配体蛋白质，抽提物过柱后，用低盐溶液洗脱下未结合的物质，然后用高盐溶液或SDS洗脱下结合在柱上的蛋白质。有时污染物的存在会影响相互作用的结果，因此蛋白质纯化是蛋白质亲和层析成功的前提。 蛋白质的纯化方法获得纯化蛋白质的一个简单方法就是利用融合蛋白，目前常用的融合蛋白为谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase, GST)，可以在谷胱甘肽-琼脂糖柱上纯化。其他的还有staphylococcus蛋白A可在含IgG的柱上纯化；含少数组氨酸的肽段在镍柱上纯化；麦芽糖结合蛋白可以在含直链淀粉的柱子上纯化。 蛋白质亲和层析 检测方式在亲和柱上，可以利用纯化的融合蛋白以两种方式检测相互作用。一是将融合蛋白共价链接在树脂上，让抽提物过柱；二是把融合蛋白共价结合在珠子上，使抽提物和珠子混在一起。 优点利用蛋白质亲和层析来检测蛋白质的相互作用有以下四个方面的优点： 灵敏度高：在高浓度固定蛋白质的条件下，可以检测微弱的相互作用（结合常数为10-5mol/L), 而生理上相关的最微弱的相互作用在10-3mol/L范围内。 可以同时检测抽提物中所有的蛋白质，即所有蛋白质与固定蛋白质的结合机会均等。 通过构建突变体，可以检测与特异性相互作用有关的蛋白质结构域或关键的氨基酸残基。 可以检测多亚基蛋白质之间的相互作用。 出现假阳性结果的原因及部分消除办法虽然蛋白质亲和层析技术能有效地检测蛋白质相互作用，但是也存在一些假阳性的结果，原因有以下几点： 电荷间的相互作用是带电性质相反的两种蛋白质相结合；可以用带相同离子电荷的对照柱来消除。 通过B蛋白，A蛋白与亲和柱上检测蛋白质间接结合。 两种蛋白质的细胞定位不同，但是人为因素提供结合机会，有的甚至能高特异性结合。一个最著名的例子就是肌动蛋白与DNase之间的高亲和力。2.1.2 亲和印迹蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到NC膜上，然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。该技术与Western blotting有些类似，只不过Western blotting是利用抗体的探针。复杂的蛋白质混合物，如全细胞裂解液，通过该技术可以直接分析，而不需要纯化，因此，该方法特别适合于分析膜蛋白，如细胞表面受体。在凝胶电泳之前，可以先分离细胞裂解物以提高该方法的灵敏度，使低丰度蛋白质的相互作用也可以被检测到。该方法涉及几个关键：膜上蛋白质的生物活性蛋白质配体的制备检测方法通常混合物在有SDS存在的情况下分离，而在印迹时需要去除变性剂，使变性蛋白质的全部或部分变性。如果蛋白质在变性后无法复性，那就需要一个非变性的胶分离系统。蛋白质探针的制备有多种方法，探针可以用放射性标记，也可以用生物素标记，或是使用亲和标签等方法。2.1.3 免疫共沉淀 概念：免疫共沉淀是一种经典的检测蛋白质相互作用的方法，其实验过程比较简单。裂解细胞后，加入抗体，抗原被沉淀下来后洗涤，去除非特异性结合，再分析结合复合体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。被分析的蛋白质可以加上一个抗原决定簇的标签，如12CA5、c-Myc，便于用特异性的抗体检测。 免疫共沉淀实验的真实性需要用以下几条标准来验证 抗原的沉淀是由于本身抗体的结合引起的，而不是制备中被污染的抗体。单克隆抗体不存在这个问题；在使用多克隆抗体时，需要对该抗体进行预处理，即将抗体与不包含抗原的抽提物混合在一起，去除与抗体结合的污染物。 只有在抗原存在的情况下，加入抗体后，才能检测到沉淀蛋白质，即抗体本身不识别沉淀蛋白质。 这种相互作用是否直接或是通过第三个蛋白质引起的。 相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂解的结果。 免疫共沉淀的优点 与蛋白质亲和层析一样，它检测的是细胞裂解原液中所有蛋白质与检测蛋白质的相互作用； 抗原和抗体的相互作用是在生理浓度的条件下被检测的，因此过量表达所带来的假阳性结果可以被排除； 可以检测到在体内形成的天然复合体，如果该复合体无法在体外条件下形成； 天然状态的蛋白质如果经过翻译后修饰，依赖于或不依赖于修饰的蛋白质，相互作用可以被检测到。 免疫共沉淀的缺点虽然该方法应用广泛，但也存在一些明显的缺点。 有时免疫共沉淀的蛋白质并非直接相互作用。如EIA与p107可以相互作用，p107与cyclinA可以相互作用，EIA与cyclinA能同时被免疫沉淀。 与其他方法相比（如蛋白质亲和层析），免疫共沉淀的灵敏度不高，这是由于抗原浓度低于亲和层析中的蛋白质浓度造成的。2.1.4 化学交联法(Chemical Crosslinking Approach) 方法使用一种交联剂，并且在交联试剂的光激活部分带有标记，将该试剂耦联到一蛋白质上，耦联体与抽提物温育在一起。如果抽提物中的A蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用，光激活后交联剂的一部分就结合到A蛋白上。加入还原剂、切割交联试剂，使A蛋白上带有交联剂上有标记的部分，然后通过凝胶电泳等方法分析该蛋白质。图 优点利用交联技术检测蛋白质相互作用的优点有： 它能检测到微弱的相互作用； 它能检测到动态过程不同阶段与不同蛋白质的瞬时相互作用，如糖基化过程； 通过能穿膜的交联试剂，交联可在体内发生。 缺点主要缺陷是没有选择性，交联试剂可与近范围内的蛋白质发生反应。所以，有时所检测到的蛋白质相互作用可能是个假象，需要通过其他方法加以验证。2.1.5 荧光共振能量转移法(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 方法FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象，它指的是当一个荧光分子（即供体）受到激发时，能量向邻近的另一荧光基团（即受体）转移的过程。但仅当受体与供体间的距离小于10 nm且受体的吸收光谱和激发光谱有重叠时，FRET才能发生，并且随着光谱重叠的增加，FRET的效率将增高，同时FRET可能发生的距离也将增加。使用FRET可用来检测蛋白质之间的相互作用，将两个蛋白质分别使用CFP/YFP（或BFP/GFP) 标记，当两者在同一细胞中表达时，只要检测到FRET发生，则证明两个蛋白质间的距离小于10nm，存在相互作用。用此方法已经成功地验证了CFP-钙调蛋白与M13-YFP融合蛋白间、FHL3与FHL2、EGF受体与Grb2等蛋白质之间的相互作用。 优、缺点GFP-FRET将活体高分辨率观测和细胞、亚细胞定位相结合，使得用显微镜观察纳米水平的距离变化成为可能，为人们在活体中观察生物大分子的相互作用提供了一个有效方法。但是，在活体GFP-FRET的研究中，常常存在着信号太弱、细胞自发荧光等不利因素影响实验结果。2.1.6 生物传感器技术即BIA (biomolecular interaction analysis)-core，生物传感器的工作原理是基于表面等离子共振 (surface plasmon resonance, SPR)，即配体和分子结合时会引起作用平面（平面或近似平面）折射率的变化。这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传递到计算机，再由计算机还原为模拟的生物信号。BIA-core以共振单位 (resonance unit, RU) 来衡量，1,000 RU相当于每平方毫米1纳克的质量。采用生物传感器检测芯片上的配体与待检分子的结合时，需要考虑很多因素的影响，如原料输送速率、配体种植密度、待检分子浓度、以及这种结合本身的亲和力大小等。原料输送速率是指分子从输送流层投递到芯片表面的速率。这些参数可直接或间接地被实时测量，由计算机推算出初始结合速率。BIA-core除具有现代生物传感器的基本特点外，最大的特色在于其附带的分析软件。它内置若干描述蛋白质相互作用的方程模型，在模型的基础上根据采集的数据给出结合速率对各参数的偏微分方程，计算出初始结合率。采用人机对话框，可根据要求作图和给出数据。同时生物传感器也可与质谱联用，直接监测芯片上配体所捕获的分析物分子的相对分子质量。2.2 分子生物学方法2.2.1 酵母双杂交酵母双杂交系统于1989年由Fields和Song创立，是用来研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而有效的方法，又称为“相互作用陷阱”。双杂交系统通常在酵母细胞中构建，首先需要构建两种杂合反式作用因子，将蛋白质X与报道基因转录因子的特异BD (DNA binding Domain, DNA结合结构域，如Gal4-BD, LexA-BD) 融合，成为“诱饵”蛋白。蛋白质Y与特异的AD (activation domain，转录激活结构域，如Gal4-AD, LexA-AD) 融合为“猎物”蛋白。当编码两种结构域的基团在细胞核内同时表达时，若蛋白质X和Y之间存在相互作用，就会使AD和BD两种结构域的上游活化序列相互接近，进而激活转录过程，使报道基团得到表达。上游活化序列，目前应用最多的是E. coli的LacZ基因，它表达后能在X-Gal的培养基上产生蓝色菌落，阳性结果易于判断。除此之外，营养缺陷型筛选也应用较多：通过在缺乏相应氨基酸（如组氨酸、亮氨酸）的培养基上菌落生长与否来判断His3、Leu2等报道基因是否表达。现在多提倡两种报道基因同时应用，即颜色筛选与营养筛选同时进行。双杂交系统普遍构建于酵母细胞中的原因，是因为酵母细胞便于转化，结果易于筛选，而且内源性酵母蛋白质极少与哺乳细胞靶蛋白结合，避免了对文库编码蛋白质的干扰。酵母双杂交系统自建立以来已迅速发展成为一种常规的分子生物学技术，并得到了广泛的应用，并在原基础上，发展了反向双杂交体系 (reverse two-hybrid system) 和三杂交体系 (three-hybrid system)。 反向双杂交体系该体系的核心是在于构建一种反向筛选的报道基因，即蛋白质间的特异相互作用所激活的报道基因表达能阻碍转化体的生长，从而形成发现蛋白质间结合解离的选择环境。已知URA3基因产物一方面为合成尿嘧啶所必需，同时又能催化5-flouroorotic acid (5-FOA) 转变为一种有毒物质。在Vidal等构建的酵母菌株中，URA3基因的表达受到含Gal4结合位点的启动子的调控，利用尿嘧啶的缺陷培养可以筛选出与“诱饵”蛋白相互作用的蛋白质（阳性筛选），而在添加了5-FOA的培养基中，存在蛋白质相互作用的菌株却会因毒素作用而死亡（阴性筛选），只有发生了蛋白质间解离或部分解离的转化株才可以表现出抗性而存在。图另一种反向筛选系统为分离杂交体系 (split-hybrid system)，在此体系中存在着两个报道基因。第一个报道基因包含着E. coli tet抑制子 (TetR) 的编码序列，第二个报道基因为His3，启动子区插入了tet操纵子序列。双杂交产生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，从而抑制了阳性筛选标志His3的表达，此时野生型相互作用使宿主细胞表现为组氨酸营养缺陷型。而只有那些作用蛋白质间已发生解离或部分解离的转化株可以在组氨酸缺陷的培养基上生长。图反向双杂交体系作为双杂交体系的补充，在研究蛋白质相互作用中发挥着日益重要的作用。在筛选蛋白质突变体时，反向双杂交体系能从大量突变体中直接筛选出导致蛋白质间相互作用减弱或消失的突变位点，而传统的利用LacZ报道基因来筛选的工作量大，且带有盲目性。反向双杂交能够发现可导致已知蛋白质间特异相互作用发生解离的肽类或其他小分子物质。传统双杂交体系的假阳性问题来源于文库中的许多片段具有自动激活报道基因表达的活性。如果能够应用反向双杂交对文库进行“预清除”，则有可能大大减轻以后的假阳性鉴定的负担。 三杂交体系是在双杂交体系上发展起来的另一分支，主要用于研究多蛋白质复合体之间的相互作用。融合蛋白BD-X和AD-Y在酵母细胞核内表达时，同时有第三种蛋白质Z表达。X和Y不能直接发生相互作用，必须通过桥梁蛋白质Z，X和Y才能发生相互作用，从而激活下游报道基因的转录。图由于在单个酵母细胞中，传统的双杂交体系只能研究两个蛋白质之间的相互作用，所以，在研究蛋白质复合体时，由于没有复合体中其他蛋白质的作用，多肽链可能会暴露出生理状态下为其他蛋白质所覆盖的某些位点，因此造成假阳性或假阴性的结果。而在三杂交体系中，加入表达受到调控的第三种蛋白质可以使蛋白质复合体的相互作用更符合生理状态。因此，三杂交体系是对双杂交系统的一个有益补充。以此为基础，甚至可以再构建四杂交体系和反向三杂交体系，以研究更广泛的蛋白质相互作用。同以往研究蛋白质相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有独特的优势。融合体蛋白质之间的相互作用在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他体外生化检验方法所无法比拟的，因此与后者相比，它所证实的蛋白质间的相互作用将更加接近于体内的真实水平。双杂交系统最大的应用价值在于它可以筛选cDNA文库中编码与已知蛋白质特异作用的成分。这种筛选过程不但揭示了许多已知蛋白质之间的未知作用，而且有助于发现许多新基因。双杂交系统检测到的相互作用在体内发生，不需要额外的纯化步骤；此外，它能检测到短暂的相互作用，目前已被广泛地应用于信号通路的研究。但是，酵母双杂交系统也存在一些局限性，包括： 它只研究在核内表达的蛋白质的相互作用，融合蛋白的构建可能会影响到蛋白质本身的活性或折叠状态； 如果特定的翻译后修饰在酵母细胞中不发生，则不能检测到修饰后蛋白质的相互作用； 许多蛋白质与BD融合后，具有自激活效应，导致假阳性结果。2.2.2 噬菌体展示 (Phage disp lay techniques, PDT)噬菌体能在其表面表达一种融合蛋白，该融合蛋白包含外源肽段，可与抗体结合。通过免疫亲和纯化，“融合型”噬菌体得到富集。将文库基因构建到噬菌体中，然后筛选出与特异抗体相互作用的蛋白质，这一过程就被称为“淘选”。抗体通常固定在塑料盘上，不能结合的噬菌体被洗脱掉，而结合的噬菌体被保留了下来，感染E. coli，经过几个星期后，可以富集结合紧密的肽段DNA序列。图丝状噬菌体，如M13、fd、f1，在其表面大约有5个拷贝基因编码的被膜蛋白，因此异源的DNA序列可以插入到该基因中，得到多拷贝的融合蛋白，被称为“多价展示”。而另一编码被膜蛋白的基因可以产生2,700个融合蛋白的拷贝。通常情况下，多价展示只局限于小肽段，因为插入大片段会影响被膜蛋白的功能和噬菌体的感染力。在研究蛋白质相互作用方面，噬菌体展示有以下几个方面的优点： 高度的选择性每一个周期中筛选出的噬菌体感染E. coli后，该噬菌体可得到1,000倍甚至更多的扩增，几次循环后，可得到相互作用的序列。 可以构建大的噬菌体文库 (1091010)，亲和纯化可在高浓度 (103 Phage/ml) 下进行。 通过改变洗脱步骤的严格性，来评价融合蛋白结合的特异性。但是，噬菌体展示方法也存在一些缺点： 多价展示中对于肽段大小的限制； 蛋白质必须要有能被E. coli分泌的特性； 因为是体外实验，蛋白质在宿主细菌中有时无法正确折叠或修饰； 构建的融合蛋白会影响到蛋白质本身的活性。2.3 基于质谱的方法2.3.1 串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)串联亲和纯化技术 (tandem affinity purifica-tion, TAP) 是由Rigaut等人在1999年共同提出的一套分离复合蛋白的新方法，该方法兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点，为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签，该标签由IgG结合结构域 (ProtA：葡萄球菌蛋白A) 及一个钙调蛋白结合多肽 (calmodulin binding peptide, CBP) 组成，结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点（烟草花叶病毒蛋白酶切割位点）隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因，温和裂解细胞，获取细胞抽提物，将抽提物加入IgG亲和柱，TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合，在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后，再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下，被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，充分洗脱，就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质，最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。图此法的巧妙之处在于设计了一个双重的分子标签，包括A蛋白、TEV蛋白酶切割位点、钙调素结合蛋白。将TAP标签构建到靶蛋白上，然后在宿主细胞内表达融合蛋白，表达水平接近于靶蛋白的天然状态。可以与靶蛋白发生相互作用的其他蛋白质结合到融合蛋白上，形成复合体。细胞裂解物和IgG基质温育在一起，通过A蛋白复合体结合到IgG上。冲洗后，加入TEV蛋白酶，洗脱下复合体。在Ca2存在的情况下，洗脱液与包被着钙调素的珠子温育在一起，复合体就结合到珠子上。进一步洗去杂质后，加入EGTA螯合，复合体脱落。SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。2.3.2 高通量质谱蛋白质鉴定(high-throughprot mass-spectoometric protein amplex identification, HMS-PCI)使用一分子标签如FLAG标记靶蛋白，使融合蛋白在细胞内过量表达，通过免疫亲和（FLAG抗体）捕获到抽提物中靶蛋白形成的蛋白复合体，SDS-PAGE分离复合体各组分，胰酶酶切后，进行质谱分析。HMS-PCI与TAP的最大不同之处是融合蛋白在