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显微授精助孕与优生江苏医药 2000年第5期第26卷 专家论坛作者：庄广伦单位：庄广伦（510080广州，中山医科大学附属第一医院妇产科生殖医学研究中心）显微操作技术在生殖医学的应用已日益受到人们的关注。它的特点是在细胞内进行非常精细、准确的操作，从而提供辅助授精、细胞内注射基因、去除细胞核、卵子极体或胚胎卵裂球、或将这些细胞成份注入受体的细胞内。正是这类技术的进步促进了人们探索人类生殖领域的无数奥秘。无数体外授精的实践表明，各种原因不育的受精率中男性因素是最低的，受精率随着精子的质量差而下降。尽管多年人们通过药物或手术企图提高精子的质量，但是效力甚微或无效。从助孕技术或实验方法刺激精子活动或提高精子浓度以改善受精率，但是精子数目低于500000，常规的体外受精与胚胎移植(IVF-ET)仍然无法解决。显微操作辅助授精通常从卵母细胞透明带手术或直接将精子引入卵母细胞内着手。自1988年开始采用显微授精助孕，Gordongn与Talansky利用生化方法使透明带穿孔让精子进入卵膜受精，Cohen则采用部分透明带切除（PZD）同样获妊娠成功并有活胎分娩。随后SCNg将520个精子直接注进卵膜融合受精，此称为透明带下授精（SUZI）。以上方法妊娠率很低，目前很多生殖医学中心已不采用。显微授精的突破是1992年比利时自由大学中心Palermo、刘家恩等的卵浆内单精子注射（ICSI）辅助授精。正常授精率明显较PZD及SUZI高。技术关键在于（1）操作使用标准的尖平滑的注射针；（2）精子准备注射前必须制动；（3）精子注入卵浆内之前必须抽吸少量卵浆促进钙离子流入，增进卵母细胞的激活。ICSI的特点是：（1）正常受精率高，多精受精率低；（2）精子浓度、形态对受精无影响。ICSI最早应用男性因素不育，常规的IVF无法受精者，目前，不论来自新鲜收集的精液或冻存解冻精子，或来自附睾与睾丸取出精子，或冷冻解冻附睾、睾丸精子应用于ICSI均获得受精妊娠。因此，ICSI技术已成为男性不育治疗的新里程碑。自1992年以来ICSI授精助孕技术已普遍应用，而且越来越广泛，通常在一些大生殖中心，ICSI与常规IVF之比为12或23，或有更甚者。是否ICSI将取代常规IVF，ICSI增加的原因有因男性不育患者精子质量越来越差，也有中心唯恐常规IVF受精失败及其他商业性因素而增加使用ICSI技术，再者近期不少报道有关IVF与ICSI对早期胚胎发育、产科结局与出生小孩追踪没有任何差别，对广泛使用ICSI起到催化作用。其实ICSI决不能替代常规IVF，正因为ICSI通常采用不经自然选择的精子注入到卵浆内受精，故不可避免存在将精子缺陷基因传给下一代所产生的危险性，特别是少弱精的男性，为此提出ICSI前男性患者基因缺失的筛查以及植入前遗传学诊断（PGD）。关于常规IVF不受精使用ICSI再次受精（late ICSI），其最终妊娠率低至极微，几乎为零，其原因在于卵子老化或与种植窗不同步，目前很多中心不做late ICSI。仅管目前的ICSI技术已发展到非常成熟阶段，但仍有若干问题有待进一步观察作出确定。PGD是辅助生育技术与高特异性分子遗传学技术结合发展起来的新技术，它可以在人类最早期阶段即68细胞时期取出12细胞进行疾病的检测，从而筛选出正常胚胎进行移植，1990年Handyside首先报告使用PGD选择性别使1例X性连锁性隐性疾病携带者获得健康婴儿。至1997年全世界已有166个经PGD出生的正常婴儿。目前PGD在优生范围内可以进行的有性连锁性隐性疾病、染色体数目与结构异常、单基因疾病及高龄妇女非整倍体检测，可以说是产前诊断一种最早最合理的补充措施。PGD技术的难点在于两方面：一是胚胎细胞活检，二是单细胞诊断技术。胚胎细胞活检必须安全有效，目前一般在8细胞时期，通过透明带打洞，即可用机械部分透明带切除或Tyrodes酸消化及新近使用的激光打洞，再使用平口针吸出胚胎内细胞。经过活检可导致胚胎细胞数目减少，胚胎发育延迟，但不致影响发育的潜能。评估PGD安全性在于囊胚形成率、孵出率、种植率以及新生儿随诊率，目前还没有资料表明PGD会导致先天异常增加。PGD诊断的技术主要包括PCR和荧光原位杂交及其由PCR和荧光原位杂交衍生的一系列技术。PCR技术主要用于单基因疾病的诊断，主要包括地中海贫血、进行性肌营养不良、囊性纤维病等。而荧光原位杂交技术主要用于染色体疾病的诊断。PCR和荧光原位杂交均可用于性连锁疾病的性别鉴定。单细胞PCR的主要问题在于单个拷贝的扩增可能导致扩增失败，以及PCR的高度敏感致污染的可能，而荧光原位杂交能进行特异染色体的检测，实验整个过程可从形态上观察，在进行性别鉴定时有其优势，但也容易受杂交失败或信号过弱的影响。对于染色体核型为45XO的胚胎细胞来说，无论是PCR还是荧光原位杂交都无法做出诊断。因此，在进行临床PGD时分别分离两个细胞进行诊断较分离一