器官移植的免疫学应用基础研究2009CB522400-G.doc

项目名称：器官移植的免疫学应用基础研究首席科学家：郑树森 浙江大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：浙江省科技厅 教育部一、研究内容（一）关键科学问题1. 阐明移植抗原致慢性移植物失功的免疫学分子机制及慢性排斥反应发生发展中的关键调控环节；2. 揭示移植器官在全身性免疫抑制状态及移植物局部组织微环境下病毒/肿瘤免疫逃逸的新特点，阐明移植后原发疾病复发的免疫学机制，实现免疫干预移植排斥反应发生发展条件下的特异性抗感染、抗肿瘤免疫；3. 揭示不同移植受者对免疫抑制剂反应差异的遗传学基础，优化免疫抑制剂个体化应用方案；研制诱导移植免疫耐受形成的新型免疫抑制剂并阐明其免疫学机理。4. 以原创性的外周T细胞免疫调节亲合力模式为切入点，阐明机体免疫系统如何达到自我、非我辩别的机制；揭示获得性特异性移植耐受的产生机制，从而实现建立受体对移植物的特异性永久性免疫耐受。同种异体排斥反应、感染及原发疾病的复发、免疫抑制剂毒副作用是困扰器官移植的难点问题。项目从器官移植受者免疫系统对供者移植抗原的特异性免疫识别与应答来诠释慢性排斥反应的发生机制，为慢性移植排斥的防治提供新方法；探讨免疫抑制状态下肝脏免疫状态的变化与乙肝病毒再感染/肝癌复发转移的相关性，为肝移植术后的原病复发建立分子水平上的早期诊断、预后判断指标和防治方案；结合循证医学、群体药物动力学、药动学-药效学结合模型研究，阐明免疫抑制药物在人体的作用规律及药物与人体的相互作用，从传统的药理性量效关系转为治疗性量效关系来研究器官移植受体免疫抑制药物的药效学及毒性预测，做到真正的个体化用药；通过开发筛选新型免疫抑制剂及调节剂，建立获得性特异性成年移植耐受动物模型，实现人体对移植物的特异性永久性免疫耐受。（二）主要研究内容本项目在前期研究工作的基础上，对器官移植领域中的关键科学问题，以免疫学为核心主线，分为四个研究方向进行探索，以期获得基础研究与临床应用两个层面的突破性进展。研究方向一：器官移植慢性失功的机制与应对策略在特异性抗原致移植器官慢性失功的免疫学机制研究方面， 基于移植排斥、缺血再灌注损伤和感染等免疫学和非免疫学因素都会引起或伴随MIC的表达上调，而诱生性抗原MIC表达上调及其与受体NKG2D结合引发的各种天然和获得性免疫反应可能是导致CGD的重要通路之一，研究调节MIC表达的有效手段和CGD干预的靶点，为防治临床移植器官CGD提供新手段。此外，通过HLA基因系统的单核苷酸多态性（SNP）扫描及测序分析研究建立人类HLA基因重组及连锁不平衡图谱以分析中国汉族人群HLA基因多态性及分子结构多样性的特点,期望能够筛选出能用于供受体匹配的HLA单倍型块或TagSNP。进一步分析HLA基因系统多态性和HLA分子三维结构多样性对移植排斥以及GCD的影响。探索建立HLAStrucMarker的移植可允许错配和禁忌必配抗原评价标准，应用于优化同种异基因HLA不完全匹配移植病例的供体选择。在免疫识别与应答的负相调控机制及其对移植排斥反应的干预研究方面，主要研究免疫相关分子，包括TLR、糖皮质激素诱导蛋白GILZ等，对DC免疫识别和免疫调控的作用及其机制，进一步阐明免疫反应及慢性移植排斥发生的分子机制，为移植排斥的防治提供新思路；深入研究T细胞活化过程中TIM家族在T细胞活化过程中的表达及信号传导机制及其在慢性移植排斥发生发展中的作用，探讨选择性阻断该通路对慢性排斥反应的防治作用，寻找防治器官移植排斥的新途径；研究T细胞活化信号转导过程中胞浆内、细胞核内重要的信号调节蛋白的功能、分子与分子作用机制以及调控T细胞活性的作用机制，筛选分子靶点，设计阻断剂并观察干预移植排斥反应的作用效果。在脂类分子代谢与移植物慢性失功的研究方面，探索脂类分子代谢的调控与脂类生成、吸收和降解等相关的分子机制；利用移植物慢性失功的动物模型研究慢性失功器官的小血管硬化病理变化与脂代谢调控机理，及引起的脂类代谢物异常的关键蛋白基因表达调控的变化，同时了解脂类分子代谢对慢性失功脂代谢调控的重要途径和关键位点，阐明脂类分子代谢在移植物慢性失功病理变化中的作用机理及其与移植物慢性失功发生、发展的关系。应用脂类代谢组学方法，分析和筛选脂类代谢物变化，确定移植物慢性失功发生过程中重要脂类代谢网络的异常改变，并根据所发现的相关的关键酶蛋白调控作用，分析确定脂类代谢异常的调控位点，进一步阐明移植物慢性失功发生时脂类代谢调控的重要途径。研究方向二：器官移植原发病复发的研究在肝移植术后乙肝复发机制及干预的研究方面，从肝移植术后肝脏免疫微环境改变、HBV免疫逃逸机制及可能的治疗方案三个层面入手，以HBVDNA基因变异、抗原识别/递呈、免疫细胞趋化/归巢、淋巴细胞活化/凋亡为研究对象，从分子水平研究移植术后乙肝病毒免疫逃逸的机制，研究抑制HBV对移植物再感染的免疫治疗新方法。揭示亲体肝移植术后肝脏再生抑制的免疫学机理，探索HBV 感染肝细胞和再生肝细胞对损伤的高度易感性、HBV 感染肝细胞再生的超迟缓性的细胞与分子机制及应对策略。在肝癌肝移植术后肿瘤复发的预警体系的建立与应用方面，由于肝脏基质微环境与肝移植术后肝癌复发关系密切，进一步研究肝移植术后肝脏基质微环境变化及其调控途径，揭示其与肿瘤细胞相互作用的分子生物学调控机制，明确肝癌肝移植术后早期肝内肿瘤微转移的主要机理；利用基因组学、蛋白组学等技术对肝癌干细胞、肝癌细胞、肝正常干细胞的基因表达谱、细胞内外蛋白表达谱及信号转导通路进行分析比较，结合相应肝癌肝移植术后患者的随访资料，筛选出和肝癌肝移植术后肿瘤复发转移高度相关的候选基因，为肝癌肝移植术后的复发和转移建立分子水平上的早期诊断及预后判断指标，并对肝癌干细胞的可能来源作初步探究，同时结合现有的靶向基因-病毒治疗的基础，研制出针对肝癌干细胞的靶向基因-病毒治疗系统。 在器官移植受者感染及其免疫机制研究方面，主要探索器官移植受者术后感染发生发展的机制、病原体谱。通过建立临床感染病原体的高通量基因组学芯片诊断技术，建立器官移植感染病原体库进行移植感染的免疫机制研究，探索器官移植受者全身免疫和粘膜免疫与感染发生的相关机制。 研究方向三：器官移植个体化用药的应用研究免疫抑制剂在不同群体中的药物信息体现是有很大不同的，主要体现在如何了解与利用这些差异，做到真正的个体化用药，意义重大。 在优化免疫抑制剂个体化应用方案研究方面，主要从负责免疫抑制剂吸收、代谢、转运、排泄、效应靶的基因的多态性来揭示不同个体对免疫抑制剂的反应（包括药物动力学、药效学、药物毒副作用等方面）呈现出很大差异的原因；考察器官移植患者生理、病理因素、药物基因组学特征以及随机效应对免疫抑制剂药动学的影响，估算器官移植受者口服免疫抑制剂的群体药动学参数，确立最终回归模型，结合Bayesian反馈法快速设计个体化给药方案；从细胞、分子水平来探讨现行免疫抑制剂对移植免疫耐受的潜在影响，寻找免疫抑制剂临床药效学的客观指标，采用WinNonlin软件建立药动学-药效学结合模型，预测药效与毒性；优化肝移植术后抗病毒和抗肿瘤治疗方案。最终为我国器官移植受者的免疫抑制剂个体化给药提供全面的参考。 在新型免疫抑制剂的研发方面，以新型免疫抑制剂J2为研究核心，在动物模型上检测新型免疫抑制剂J2的最适给药剂量,途径，起始间隔或者持续时间，以及最合适的联合用药方式；同时，深入探讨新型免疫抑制剂J2在抗慢性排斥反应、诱导移植免疫耐受中的可能应用及其免疫学机理，为其进入临床应用提供理论基础，并逐步进入临床试用阶段。研究方向四：永久性特异性成年移植耐受动物模型的建立及其机理研究本项目所提出的“外周T细胞免疫调节亲合力模式”（以下简称“亲合力模式”）假说的核心概念在于，免疫系统不是以识别自身或外界抗原结构上的不同，而是以感受T细胞活化亲合力的不同，而达到外周“自我非我辨别”的目的。在操作执行水平上，免疫系统则以选择性地下调针对所有抗原（包括任何自身或外界抗原）的具有中等亲合力的T细胞为手段，来达到外周辨别自我非我的目的，从而特异性地确保自身耐受。这一概念基于胸腺阴性选择在外周造就了一个具有高亲合力的抗外界抗原T细胞群体和一个缺失高亲合力的自身反应性T细胞群体。后一群体包含带有中等亲合力的致病性自身反应性T细胞，因而选择性下调所有中等亲合力T细胞，即可特异性地控制对自身抗原的免疫反应，却又不损伤由高亲合力T细胞所介导的对感染性外界抗原的免疫应答。获得性特异性移植耐受，可通过人为地删除高亲合力的抗同种抗原T细胞，并选择性地下调中等亲合力的抗同种抗原T细胞的自然调节机制而实现。 本研究方向以原创性的“亲合力模式”的学术假说作为指导思想，通过获得性成年移植耐受动物模型的建立及其机理研究，阐明免疫系统如何达到自我非我辨别的原理，进而从生物学角度探索如何特异性地把一个移植抗原转换成一个自身抗原，从而在避免长期使用非特异性免疫抑制手段的前提下，建立起对移植物的永久性特异性免疫耐受，这将有助于从理论和实践上解决慢性排异和移植物慢性失功问题。二、预期目标（一）总体目标 从供者特异性移植抗原、移植感染和原病复发及免疫抑制剂合理应用、免疫系统如何识别自我与非我从而达到“自我非我辨别”等角度，深入研究移植物慢性失功的免疫学机制和调控手段，阐明肝移植术后肝脏微环境改变对乙肝和肝癌复发的影响及其分子机制，阐明获得成年移植免疫耐受的细胞和分子机制，制定疗效明确的个体化免疫抑制方案，减轻移植物慢性失功，提高移植物和移植病人长期存活率。培养一批具有国际学术视野和自主创新能力的器官移植基础与应用结合的复合型中青年学术带头人和科技骨干，在我国形成一支高水平高素质的器官移植和移植免疫学术研究队伍。（二）五年预期目标1、建立HLA分子三维结构匹配预测系统并完成临床大样本验证，为临床提供HLA配型新策略和手段。2、确定诱生性抗原及其诱导因素在慢性移植物失功CGD的作用、阐明CGD发生发展的关键分子及其调控规律，建立CGD研究和干预的新理论、新技术、新模型。3、明确自主发现的免疫新分子在移植抗原特异性免疫识别与应答过程中的负相免疫调控作用和机制，建立慢性移植排斥的免疫负向调节新方法和新策略。4、揭示肝移植术后乙肝复发的分子机制，通过免疫调节建立阻断HBV对移植物再感染的新方法，预防肝移植术后乙肝复发。5、揭示移植术后肝癌复发和转移的分子机制，建立有效的预警和防治方法。6、筛选新型抗慢排免疫抑制药物，制定疗效明确的个体化免疫抑制方案。7、以“亲合力模式”的概念为指导思想，建立永久性特异性成年移植耐受动物模型，验证Qa-1/HLA-E限制性CD8+T细胞参与移植器官免疫调控的科学性、准确性和临床初步应用的有效性。8、发表SCI论文200篇以上，其中IF5.0 30篇；出版专著5部以上；申请专利20项以上。三、研究方案(一)总体思路从特异性抗原识别、激活，特异性免疫调控以及免疫系统对自我非我的识别入手，阐明移植免疫的相关抗原和关键免疫分子的调控规律，探讨重建和维持移植受者正常免疫监视和防御状态的新机制、新方法、新策略以及实现获得性移植耐受的可行性；以提高移植肝和移植受者存活期和存活质量为目的，明确器官移植后原病复发、感染和移植物慢性失功的免疫学机制和干预措施、阐明建立获得性移植耐受的细胞和分子机制；设计和研制选择性干预移植排斥反应的防治方法，实现安全、有效、经济的个体化诊疗新方案。（二）技术路线供者/供器官质量评价供受适配性评价固有抗原评估诱生性抗原评估慢性失功生存期和生存质量下降慢性失功机制及干预提高受者和移植物生存期和生存质量获得性成年移植耐受动物模型的建立免疫识别、细胞趋化、移植排斥长期服用免疫抑制剂特异性抗原表达时效、量效监测及免疫负向调节免疫抑制剂安全性、有效性和经济性评估移植物移植受者感染病原免疫代谢异常药物毒性移植感染病原及机制免疫代谢异常干预药物基因型和药效监测损伤修复免疫学机制病毒复制机制及干预肿瘤复发机制及干预损伤与修复病毒感染肿瘤复发各种疾病致脏器功能丧失器官移植组织配型（三）创新点1、思路创新：本项目综合利用当前国内外免疫学、移植学、分子生物学、药物学、循证医学和医学信息学等领域的最新研究成果和技术手段，以具国情特色的乙肝肝移植为对象，从研究移植肝慢性失功、乙肝和肝癌复发的免疫学机制和干预入手，重建移植受者免疫监视和防御状态开展综合研究的思路，未见报道。2、理论创新：基础和临床相结合，系统研究免疫抑制状态下的肝脏微环境改变，肝移植后的肝脏再生的细胞和分子机制，有望创建肝脏移植免疫新理论。3、应用创新：首次从遗传多态性、群体药动学、药动药效结合模型研究入手，进行免疫抑制剂血药浓度与临床疗效及毒性关系的相关性研究，揭示个体药物反应差异的机制，制定科学的免疫抑制剂临床使用指南，指导临床个体化用药方案。 （四）可行性分析 1、我国拥有世界上最大的临床移植潜在需求，如最大的乙肝相关性肝病肝移植和原发性肝癌肝移植临床病例和潜在患者群；小肠移植、肾移植及多器官联合移植在亚洲均处领先地位。项目组拥有大宗病例的各类临床器官移植及相关临床资料，为移植相关研究提供有力的临床支持。2、项目组集结了全国移植界绝大多数优势移植临床和基础研究资源，包括9个大学/研究所，2个国家重点实验室，7个部级和2个全军重点实验室，拥有一流的基础设施和研究设备。项目组人员均由国内相关领域具有丰富经验的研究人员组成，长期从事移植相关研究工作；熟练掌握了肝脏移植、胰腺及胰岛细胞移植、肾脏移植、小肠移植、心脏移植、CGD等动物模型；建立了国内唯一的无菌动物培育实验系统、肠道细菌研究系统；建立了基因组学、蛋白组学、代谢组学及生物信息学研究平台，为研究的顺利深入开展提供了雄厚的技术支持。3、项目组执行前一个973项目过程中，在肝移植后乙肝复发的防治、免疫抑制药物的个体化应用、肠道微生态与脏器移植后感染的相关性及机制、脂类分子对移植物慢性失功的影响、肝癌肝移植后肿瘤复发的早期预警体系、移植物慢性失功的免疫学机制及干预等移植相关研究领域取得了令人鼓舞的研究成果，积累了宝贵的研究经验，为进一步开展后续研究，取得突破性研究成果奠定了坚实基础。4、新的研究思路、手段、挑战和机遇：本项目基于前期研究的创新结果，进一步整合和优化当前得到的最佳证据、知识、技术和人才，针对中国特色的乙肝相关性肝移植等临床移植受者长期存活的关键因素协同攻关；同时，我国第一个器官移植条例颁布、活体器官移植确保供者安全的挑战和全民医疗保障中大病保险险责制等带来的新机遇，既为我们组织的研究内容提供了对象，又为研究成果的快速转化提供了平台，为项目组取得重大突破提供了各方面的保障。（五）课题设置课题一：特异性抗原致移植器官慢性失功的免疫学机制研究 主要研究内容：1.系统评价全球此前所有器官移植数据，以移植器官选择条件、存活率和存活时间为标准，进行大样本回顾性分析，寻找慢性失功的器官特异性，确立慢性失功的高发、早发器官种类。2从中国汉族人群群体HLA基因多态性及分子结构多样性的特点，探讨其对临床移植效果的影响及可能作用机制。3基于HLA分子三维结构多样性，建立快速筛选最佳移植供受组合的指标体系和新策略。4建立CGD高发、早发动物模型，探讨诱导诱生性抗原MIC上调表达的免疫学和非免疫学因素及其相互作用，进一步深入研究CGD的机理。5深入研究MIC表达规律和特点，寻找调节MIC表达的有效手段和CGD干预靶点，为临床移植器官CGD的防治提供手段。主要研究目标：1. 确定慢性移植物失功CGD复杂成因的相互关系、阐明CGD发生发展的关键分子及其调控规律，建立CGD研究和干预的新理论、新方法、新技术、新模型。2、甄别CGD发生发展过程中的相关信号分子，建立移植病人CGD发生发展过程监测和早期预警的临床病理方法技术。3、在国际上首次进行基于高密度连锁不平衡图谱及系谱分析的中国汉族人群HLA基因重组机制的相关研究，描述我国汉族人群HLA基因多态性及分子结构多样性特点。 4、建立的HLA分子三维结构匹配预测系统，建立预测GVHD/ HVGD的技术平台，以选择最佳供体。 承担单位：四川大学 中国人民解放军军事医学科学院课题负责人：李幼平 经费比例：14.8课题二：免疫识别与应答的负相调控机制及其对移植排斥反应的干预研究主要研究内容：1、 研究免疫相关分子，包括新型免疫相关分子DIgR等，对抗原递呈细胞免疫识别和免疫调控的作用及其机制，从分子水平上解释慢性移植排斥发生或发展的分子机制，并有可能提供将来临床应用于预防和治疗移植排斥的新途径。2、 研究APC表达Toll-like receptors (TLRs)及其对LPS、TNF等炎性刺激因子的反应性影响对APC细胞的功能和免疫调节作用的分子机制，研究TLR介导的天然免疫及排斥反应的关系，阐明免疫反应的发生机制、为移植排斥的防治提供新思路。3、 研究T细胞活化过程中重要新分子-TIM家族在T细胞活化过程中的表达及信号传导机制，探讨选择性阻断对慢性排斥反应的防治作用的效果，寻找阻断T细胞活化抑制器官移植排斥的新途径。4、 研究T细胞活化信号传导过程中胞浆内、细胞核内重要的信号调节蛋白的功能、分子与分子作用机制以及调控T细胞活性的作用机制，筛选分子把靶点，设计阻断剂并观察干预移植排斥反应的作用效果。主要研究目标：1 研究免疫相关分子包括自主发现的新型免疫分子（抑制性受体等）对抗原提呈细胞免疫识别和应答的负相调控作用的机制，为慢性移植排斥的防治提供新方法。2 研究T细胞活化过程中重要新分子如TIM分子在T细胞活化介导的排斥反应中的作用，探讨选择性阻断这些分子对慢性排斥反应的防治作用。3 研究细胞活化信号传导过程中重要的信号调节分子如miRNA调控T细胞活性的作用机制，从蛋白质以及RNA水平探讨其对移植排斥反应的干预机制，找寻T细胞活化的关键分子靶点，设计阻断剂，为临床应用于防治慢性移植排斥提供的新靶点和新思路。承担单位：中国人民解放军第二军医大学 浙江大学课题负责人：王全兴经费比例：9.5课题三：肝脏免疫微环境影响肝移植术后乙肝复发的机制和干预研究主要研究内容：1肝移植术后乙肝复发的机制研究：研究乙肝相关性肝疾病肝移植受者外周血中mDC和pDC表面分子表达情况与乙肝复发的关系，研究肝移植术后乙肝病毒复制的时效规律，阐明肝移植乙肝复发的机制。2以临床活体肝移植为研究对象，供受体配对实验，研究肝移植术前术后负调节性细胞的变化规律、负调节细胞与负调节分子的整合效应。包括以CD56bright/CD16dim为表型，追踪其与负调效应相关的细胞标志（CD25, NKG2A, KIRxLs）、膜型杀伤分子（Fas-L, TRIAL, Perforin）和细胞内细胞因子（IL-4, IL-10, IL-13, TGF-b）在肝移植术前后的动态变化。以胞内细胞因子为功能性分子，观察肝移植术前后是否存在NKh1/NKh2的失衡及可能机理。以FoxP3为转录因子标记，以TGF-b或IL-10为细胞因子标记，研究肝移植术前后T-reg细胞的变化规律，同时观察Th2/Th3的特点变化。3.以各种病毒性肝炎动物模型（包括急性pAAV/HBV1.2感染鼠和 HBV 转基因鼠等），探索HBV 感染肝细胞和再生肝细胞对损伤的高度易感性、HBV 感染肝细胞再生的超迟缓性的细胞与分子机制。研究天然免疫“效应细胞” （包括NK 细胞、NKT细胞或kupffer 细胞）和“效应分子”(包括NKG2D，NKP30，NKG2A，KIR 受体)，分析天然免疫淋巴细胞和HBV感染肝细胞各种NK受体和对应膜配体的表达谱、细胞因子及其受体表达谱、相关信号通路的级联应答链等，探索寻找损伤肝细胞或“限制”肝细胞再生的免疫效应细胞及其行使功能的效应分子。4研究IL15促进pAAV/HBV1.2 小鼠肝再生的机制，分析白细胞介素15通过抑制NKT细胞分泌IL-4, IL-5 和TNF-等细胞因子的能力，减少嗜酸性粒细胞浸润到肝脏，降低其对肝脏的损伤，而恢复或促进肝再生的可能性。探讨IL15促进临床肝移植后肝再生的潜在应用价值，尝试在肝脏保护液或清洗液中添加IL15，促进临床肝移植后肝再生的效果及机理。主要研究目标：1阐明肝移植术后乙肝病毒复制的时效规律，明确mDC和pDC表面分子表达与乙肝复发的关系。阐明肝移植术前术后负调节性细胞的变化规律、负调节细胞与负调节分子的整合效应。2、阐明移植肝脏的免疫抑制微环境和HBV免疫逃逸的关系，揭示天然免疫效应细胞和分子在肝移植术后乙肝复发致肝细胞损伤的作用机制。承担单位：浙江大学 中国科技大学课题负责人：郑树森 经费比例：20.4%课题四：肝癌肝移植后肿瘤复发的分子机制和预警研究主要研究内容：1移植肝微环境与肝癌转移复发的研究。 进行人肝癌细胞株与基质细胞株联合培养，比较观察免疫抑制状态下肿瘤细胞与基质细胞的相互作用，以及肿瘤细胞侵袭能力和增殖能力的变化。 研究移植肝肿瘤复发与普通肝癌的基质微环境（包括肝星状细胞、肌纤维母细胞、成纤维细胞、肝窦内皮细胞等）特征；比较复发组与无复发组差异。 研究不同缺血再灌注损伤和不同免疫抑制背景下供肝微环境变化与肝癌微转移的相关性，探索维持供肝微环境稳态的临床肿瘤防治新策略。 开展移植肝再生与肝癌复发的相关性研究。检测围手术期外周血中细胞因子和再生分子的表达，探讨可能的细胞信号调控途径，找到复发相关分子，验证其对肝脏再生和肿瘤进展的作用。2应用基因组学、蛋白组学和生物信息学技术，揭示肝移植术后不同转移潜能的肝癌RNA及蛋白表达谱，深入研究肝癌复发转移分子机理。 应用基因组学技术，寻找调控肝移植术后肝癌复发转移的基因群，分析鉴定其蛋白产物，制备基因芯片；应用蛋白组学技术，筛选出与肝癌复发转移密切相关的特征蛋白。 针对肝癌不同转移复发潜能和不同靶位（肺、骨、肝），选取3-4个关键靶基因，在动物模型上，利用siRNA技术开展干预性研究。 结合RNA干扰和纳米生物材料两项新兴技术，建立并完善能同时高效介导siRNA和表达质粒的肝癌细胞靶向性、控释新型纳米载体系统。3肝癌干细胞与肝癌肝移植术后肿瘤复发的相关性研究。 采用FACS技术分离纯化具有肝癌干细胞特性的SP细胞和非SP细胞，利用蛋白组学技术绘制肝癌SP细胞、非SP细胞及肝正常干细胞的蛋白表达谱。 采用大样本病例SP细胞检测，阐明其与肿瘤复发转移的相关性。 通过NOD/SCID小鼠移植瘤实验，观察针对肝癌干细胞的靶向治疗系统对SP和非SP细胞的杀伤，评估其防治肿瘤复发转移的有效性。主要研究目标： 深入研究肝癌肝移植术后肿瘤复发转移的分子机理，揭示肝移植术后不同转移潜能的肝癌RNA及蛋白表达谱；探索移植肝微环境和肝癌干细胞与肝癌转移复发的相关性及其内在分子机制。 承担单位：中山大学 浙江大学 课题负责人：陈规划经费比例：9.5%课题五: 脂类分子代谢对移植物慢性失功的影响主要研究内容： 1. 探索移植物慢性失功小血管硬化病理变化与脂代谢调控机理，引起的脂类代谢物异常的关键蛋白基因表达调控的变化。了解脂类分子代谢对慢性失功脂代谢调控的重要途径和关键位点，阐明脂类分子代谢对移植慢性失功病理变化中的作用机理，与移植物慢性失功发生发展的关系。2应用脂类代谢组学方法，在移植物慢性失功发生发展过程中，分析和筛选脂类代谢物变化，确定移植物慢性失功发生过程中重要脂类代谢网络的异常改变，根据所发现的相关的关键酶蛋白调控作用，分析确定脂类代谢异常的调控位点，进一步阐明移植物慢性失功发生时脂类代谢调控的重要途径。3探索免疫抑制剂对肠黏膜屏障直接损伤作用的分子基础，研究免疫抑制剂引起的脂类代谢紊乱，形成移植动脉硬化的脂类代谢途径的改变。4在移植慢性失功形成过程中，研究鱼油对肠黏膜屏障损伤和肠源性细菌移位的干预作用及其分子机理及鱼油长期喂养对（肝、肠、肾移植）移植物慢性失功动物模型小血管硬化的改善。主要研究目标：1、阐明脂类代谢异常与小血管硬化致移植器官慢性失功的分子机制。2、确定移植物慢性失功发生发展过程中重要脂类代谢网络的异常改变及其调控途径。承担单位：南京大学课题负责人：黎介寿经费比例：9.5%课题六： 器官移植受者感染及其免疫机制研究主要研究内容：1、肝移植受者感染病原体谱变化规律：采用培养法以及基于细菌16S rRNA的聚合酶链法明确器官移植受者术后感染病原体谱、耐药谱（细菌、真菌、病毒等）及其发生的时间、部位及规律；探讨肝移植术后感染和无感染发生的患者的肠道菌群的生态变化规律，得出相应状态下不同的优势菌谱（如双歧杆菌和乳酸杆菌等）。2、肝移植后感染的免疫机制研究：研究肝移植后感染患者及大鼠外周血以及肠道淋巴结T淋巴细胞总数及CD4+/CD8、Th1/Th2平衡的变化特点，探讨移植后机体全身免疫功能变化与感染发生的相关性。比较分析在不同的肠道菌群改变状态下，肠道局部炎症变化对肝脏炎性水平的影响，为阐明肠道菌群在移植后肝脏的炎症发生、发展中所起的作用打下基础；同时检测不同脏器细菌异位情况，探讨不同的肠道菌群改变与移植后细菌易位的相关性。3、移植受者感染的组学研究：运用蛋白质组学、代谢组学和系统生物学等研究方法，动态监测患者移植后蛋白组及代谢组学变化,研究器官移植后微生物感染和代谢谱间的关系，寻找相应生物标志物，建立代谢谱快速诊断模式；进一步探讨微生物变化与代谢物间的关系，建立宿主、微生物酶谱与代谢物间的代谢网络系统。在此基础上建立相关动物模型，研究免疫抑制剂和/或抗菌药物与肠道微生物群落对肠壁局部及机体蛋白质组改变，探讨肠道细菌易位的分子机制。4、体外细菌移位模型的建立和应用：建立Caco-2肠道上皮细胞模型，运用不同种的双歧杆菌和/或乳酸杆菌来分析益生菌对肠道上皮细胞屏障功能的影响，检测细胞因子IL-6、IL-8、IL-12、TNF-，紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、ZO-3，以及TER（跨内皮细胞电阻）等，应用透射电镜和激光共聚焦，观察肠黏膜上皮细胞紧密连接膜微区域分子结构的改变，了解细菌与肠道上皮细胞的相互作用关系。主要研究目标： 阐明器官移植受者感染发生、发展的特征、免疫机制及其预后指标；明确移植受者免疫抑制剂和或抗生素对其整体代谢网络的影响，为器官移植受者感染的预防、诊断和治疗及药物研发提供理论依据和新方法。 承担单位：浙江大学 课题负责人：李兰娟经费比例：9.5课题七：器官移植受者个体化免疫抑制方案研究主要研究内容：1. 器官移植受者免疫抑制的药物基因组学研究：主要包括免疫抑制剂代谢、转运、药靶的基因多态性(特异的靶蛋白、如受体或介入信号转导等细胞事件的蛋白，主要为细胞因子、趋化因子、信号转导通路等免疫相关基因)。其中免疫抑制剂代谢及药物转运体的基因多态性分别选取最为重要的肝药酶P450系统中CYP3A、S-甲基转移酶和N-乙酰转移酶基因、ATP结合盒转运体ABCB、ABCC及ABCG等基因，免疫抑制剂药靶基因多态性选取IL-25、IL-15、TGFb、ICOS、STAT通道等作为研究对象，以研究机体免疫系统对各类免疫抑制剂的应答程度。2器官移植受者免疫抑制剂的群体药动学研究：收集进行免疫抑制治疗的器官移植患者的临床资料，包括一般人口学资料、原发疾病、外科手术记录（如移植器官重量、热/冷缺血时间等）、移植术后不同时间点的血免疫抑制药物浓度和相应的给药剂量、合并用药情况、实验室检查结果包括血常规、生化等；运用NONMEM法定量考察器官移植患者生理、病理因素、药物基因组学特征以及随机效应对免疫抑制剂药动学的影响，估算器官移植受者口服免疫抑制剂的群体药动学参数，并根据该模型计算个体药动学参数，结合Bayesian反馈法快速设计个体化给药方案；前瞻性观察、校验模型预测的有效性。3器官移植受者免疫抑制剂的药效学监测及药动学-药效学结合模型（PK-PD）研究：应用流式细胞术、液质联用仪、ELISA以及ELISPOT等方法检测器官移植术后受者不同时间点的生物体液，从细胞、分子水平来探讨现行免疫抑制剂对移植免疫耐受的潜在影响，寻找免疫抑制剂临床药效学的客观指标。在此基础上，结合计算机辅助方法，应用血药浓度与其效应的连接、药效反应系统的反应与效应部位浓度的连接、软连接和硬连接、非时间依赖型和时间依赖型连接等连接模型，采用WinNonlin软件建立免疫抑制剂的最佳药动学-药效学结合模型，预测药效与毒性。4优化肝移植术后抗病毒和抗肿瘤治疗方案：在拉米夫定联合乙肝免疫球蛋白防治肝移植术后乙肝复发的基础方案上，研究不同免疫抑制剂对病毒复制的影响，寻找最优化免疫抑制方案；采用大样本信息学分析不同免疫抑制方案下肝癌肝移植受者的肿瘤复发、转移及排斥反应发生情况，结合基因型、SNP等遗传学背景和临床参数，分析肝癌肝移植术后生存情况的影响因素，建立科学合理的免疫抑制剂标准化用药指导方案。主要研究目标：从遗传多态性、群体药动学、药动药效结合模型研究入手，进行免疫抑制剂血药浓度与临床疗效及毒性关系的相关性研究，揭示个体药物反应差异的机制，拓展客观临床药效学指标，建立最佳药动学-药效学结合模型，制定科学的免疫抑制剂临床使用指南，指导临床个体化用药。承担单位： 华中科技大学 浙江大学课题负责人：陈忠华 经费比例：9.5课题八：新型免疫抑制剂在抗慢性排斥反应中的应用及其机理主要研究内容：1建立狼疮样肾炎、硬皮病样以及综合这两种病变的慢性移植排斥反应的小鼠模型，通过病理学和免疫学检测验证模型的可靠性和稳定性。2、观察靶向CD4 D1的芳酰肼类小分子化合物J2的抗慢性移植排斥作用。课题组早期研究结果已证实J2能够通过抑制CD4+T淋巴细胞的增殖活化，阻断其介导的免疫应答，延缓小鼠急性移植排斥反应发生。本研究在慢性移植排斥小鼠模型上单独给予J2或其它淋巴细胞活化阻断剂（如FK506）或联合用药，通过免疫学、病理学研究证实其抗慢性排斥的作用并探索合适的给药方案。3深入探讨J2在体内抗慢性移植排斥作用的免疫学机理。拟通过以下几个方面开展研究：利用流式细胞术检测CD25、CD69等表面分子表达，分析药物对移植小鼠体内T淋巴细胞包括CD4+以及CD8+ T淋巴细胞增殖活化的作用；利用体外刺激和混合淋巴细胞实验观察药物对移植小鼠体内淋巴细胞转化、反应性以及分泌细胞因子的作用； 利用体外刺激实验检测药物治疗对移植小鼠体内B淋巴细胞增殖活化的影响，并利用ELISA和间接免疫荧光检测方法分析给药后移植小鼠血清中或者淋巴细胞分泌自身抗体的水平；应用ELISA以及ELISPOT方法检测药物治疗后移植小鼠体内血清中细胞因子分泌水平的变化，分析Th1/Th2偏移； 应用流式细胞分析技术，分析给药后移植小鼠体内CD4+CD25+T调节性细胞的变化，并利用混合淋巴细胞实验分析给药后移植小鼠淋巴细胞对供者小鼠以及第三者小鼠淋巴细胞刺激的反应性，探讨药物治疗诱导免疫耐受的可能机制。主要研究目标： 建立慢性移植排斥反应的小鼠模型；验证新药J2的抗慢性排斥反应作用，制定合理的免疫抑制剂给药方案；阐明其免疫学机理并探讨药物治疗诱导免疫耐受的可能机制。承担单位：中国人民解放军军事医学科学院课题负责人：肖鹤经费比例：6.7课题九：永久性特异性成年移植耐受动物模型的建立及其机理探讨主要研究内容：1、以由同种抗原诱导的新生移植耐受 (NTT) 动物模型为模版，根据“亲合力模式”的概念，用不同实验方案建立起一组获得性成年移植耐受 (AATT) 早期动物模型。2、在早期AATT动物模型的基础上，根据“亲合力模式”的概念去筛选和优化体内最佳诱导条件，以达到持续终生的生理性获得性成年移植耐受。有的放矢地调整免疫系统功能，调动协调体内免疫调控机制，避免长期使用非特异性免疫抑制的手段是建立这一持续终生的生理性获得性成年移植耐受的实验宗旨。3、系统研究所建持续终生的生理性获得性成年移植耐受的细胞和分子机制。主要研究目标：以“亲合力模式”的基本概念为指导思想建立移植脏器的免疫耐受，并提供令人信服的实验依据。验证Qa-1限制性CD8+T细胞参与移植器官免疫调控的科学性、准确性和临床初步应用的有效性；为研发出能特异性调控这一调节通路的生物制剂打下基础；建立较为成熟的实验室监测指标和标准化诱导方案。承担单位：上海交通大学课题负责人：蒋红经费比例：10.6（六）各课题间的相互关系慢性排斥反应、感染及原发疾病的复发、免疫抑制剂毒副作用等最终将导致慢性移植物失功（CGD）。本项目围绕如何防治CGD，提高器官移植受者和移植物的长期存活率这个核心问题，设置九个课题。针对移植排斥反应引起的CGD所涉及的各种机制和预防控制CGD发生发展进行系统研究。对组织配型、免疫识别、免疫活性细胞活化、细胞趋化等进行研究，揭示调节性T细胞发挥调节作用的细胞基础，阐明DC在免疫反应中所承担的核心任务；针对移植受体免疫抑制状态下易受到各类致病原（包括条件致病原）感染和肿瘤复发，结合肝脏免疫微环境，研究肝移植术后乙肝/肿瘤复发的机制和干预措施，研究内皮细胞损伤与修复、免疫活性小分子物质在CGD中的作用，为预防和控制器官移植受者感染发生、发展提供新方法和新策略；通过优化移植术后免疫抑制剂使用方案，开发筛选新型免疫抑制剂及调节剂，可以极大地减少免疫抑制剂的毒副作用所导致CGD发生，最后通过永久性特异性成年移植耐受动物模型的建立及其机理探讨，引导移植耐受的实现。综上所述，九个课题间紧密联系，环环紧扣，形成一条对CGD发生、发展和调控的强大研究锁链，最终实现移植物和受体长期存活。四、年度计划研究内容预期目标第一年1. 进行大样本回顾性分析，描述CGD高发早发的器官特征并建立相应的细胞模型和动物模型。2. 采用生物信息学及计算生物学技术研究中国汉族人群HLA基因复合体中的连锁不平衡。3. 研究新型抑制性分子DIgR1等对树突状细胞生物学特性和功能以及信号传导调节作用的影响，探讨其调控DC介导的免疫反应的作用及其抗移植排斥反应的影响。4. 免疫抑制剂引起的脂类代谢紊乱，形成移植动脉硬化的脂类代谢途径的改变。5. 以pAAV/HBV1.2 高压注射建立全新的HBV自然感染小鼠模型。分析不同免疫抑制剂对乙肝病毒复制和复发的不同状态；肝移植受者外周血免疫细胞表型和功能检测及和HBV复发的相关性研究。6. 研究免疫抑制状态下肿瘤细胞与基质细胞的相互作用。通过比较不同地域和种群肝癌患者癌细胞和癌旁的正常肝细胞基因组学和蛋白组学研究，明确肝癌干细胞的表型及生物学特性，筛选其特异性阻断作用的基因。7. 检测移植受者术后感染患者的各种病原体；观察不同种益生菌来分析其对肠道上皮细胞屏障功能的影响。8. 建立狼疮样肾炎、硬皮病样以及综合这两种症状的小鼠慢性移植排斥模型。9. 研究建立皮肤移植和肝脏移植耐受的新生小鼠模型。1. 确定CGD高发、早发的器官种类和特性。2. 初步获得中国汉族人群HLA基因复合体重组基本数据，中国汉族人群MHC连锁不平衡的精细图谱。3. 在完成DIgR1胞外段抗体的制备、携带基因的腺病毒构建的基础上，完成其对DC生物学特性和功能以及信号传导调节作用的影响，探讨其调控DC介导的免疫反应及其抗移植排斥反应的作用，确定新型抑制性分子在抗移植排斥中的作用。4. 确定免疫抑制剂引起脂类代谢异常，是形成移植动脉硬化的重要因素。5. 建立全新HBV自然感染小鼠模型。阐明免疫抑制剂和乙肝病毒复制和复发的关系;确立与HBV复发相关的免疫细胞表型。6. 明确肝癌细胞株在不同微环境调控下的分子表达谱变化。比较肿瘤复发相关基因谱和分子表达谱差异，确定原代肝癌标本肝癌干细胞的表型及治疗靶点。7. 明确器官移植受者术后感染病原体谱；初步阐明益生菌对肠道上皮细胞屏障功能的影响。8. 完成小鼠慢性移植排斥模型。9. 成功建立新生移植耐受 (NTT) 动物模型（包括皮肤移植和肝脏移植）。10. 发表SCI论文1315篇，获得1项拥有自主知识产权的高水平技术成果。第二年1. 探讨移植物血管内皮和上皮细胞损伤导致器官慢性失功的病理生理机制，鉴定其分子标志。2. 用生物信息学及计算生物学技术研究中国汉族人群HLA基因复合体中的连锁不平衡和HLA基因复合体中tagSNP及单倍型块。3. 研究APC表达TLRs及其对LPS等激动剂刺激后细胞内蛋白磷酸酶等表达的变化，通过干扰SHP1等对APC产生TNF-和I型干扰素等天然免疫因子的作用，分析其免疫调节作用与移植排斥反应产生的关系,寻找抗移植排斥的靶点。4. 移植小血管硬化形成过程中的脂类代谢物异常的关键蛋白基因表达的变化。5. 肝脏免疫微环境的变化规律及其和HBV复发的相关性研究；.研究pAAV/HBV1.2 小鼠模型诱发肝癌肝硬化后切除70肝脏，分析肝再生被抑制的机制。6. 研究免疫抑制状态下的肝脏基质微环境变化；筛选出肝癌转移相关特异的分子标志物；探讨肝癌干细胞的可能来源；筛选合适的纳米材料，进行靶向治疗研究。7. 分析长期应用免疫抑制剂患者感染发生、发展与肠道菌群结构的关系；研究免疫抑制状态下及发生感染时宿主免疫球蛋白水平、多克隆激活状况和外来抗原应答能力的变化规律。8. 分析临床移植病人自身药物遗传学特征；检测不同免疫抑制状态下各靶分子的表达；对不同乙肝病毒受者进行免疫抑制前瞻性研究，研究移植模型中包括J2在内的小分子药物，对淋巴细胞活化阻断效果。9. 研究建立肝脏移植耐受的成年小鼠模型，研究运用非特异性免疫抑制剂及抗CD28或抗CD40L单克隆抗体改造外周抗同种抗原T细胞群体结构。1. 发现内皮细胞和上皮细胞损伤致移植物失功的病理机制和分子标志。2. 建立汉族人群MHC连锁不平衡的精细图谱，建立中国汉族人群SNPs基因分型数据库，确立中国汉族人群HLA基因复合体中tagSNP及单倍型块。3. 确定LPS等TLRs激动剂刺激DC后表达GILZ、SHP1等表达的变化,明确SHP1等分子调节TNF-和I型干扰素对免疫反应的作用以及在抗移植排斥反应中的可能应用。4. 阐明引起脂类代谢物异常的关键蛋白基因表达调控明。5. 明确器官移植受者术后发生感染的特征展与肠道菌群结构的关系。阐明肝脏免疫微环境在乙肝发病中的作用；发现肝再生的抑制机理。6. 初步阐明不同免疫抑制条件下肿瘤细胞与基质细胞之间的蛋白调节变化；筛选出和肝癌复发转移高度相关的候选基因，确定肝癌细胞表面分子特异性配体纳米材料，确定其“生物靶向性”。7. 阐明长期应用免疫抑制剂患者感染发生、发展与肠道菌群结构的关系；初步明确器官移植受者对全身免疫系统的影响。8. 发现药物反应的个体差异的遗传因素；建立免疫抑制剂与细胞因子、免疫细胞状态的相关性分析体系；建立预防乙肝复发的最优化免疫抑制方案。 确定J2等小分子药物疗效。9. 成功建立成年移植耐受动物模型（包括皮肤移植和肝脏移植）。10. 发表SCI论文15篇以上；申请国家发明专利1 项以上。第三年1. 探索移植模型中诱生性抗原的表达规律、特点及分子信号通路变化，寻找有效调控手段的抗移植物慢性损伤新方法并确定其抗CGD的作用。2. 进行HLA-A,B,C,DRB1及DQB1高分辨基因分型，建立重组家系的永生化细胞株；绘制中国汉族人群家系HLA基因重组家系HLA-A,B,C,DRB1及DQB1低精度遗传图谱。3. 研究T细胞活化过程中重要新分子-TIM家族在T细胞活化过程中的表达及信号传导机制与T细胞的分化、增殖和细胞的凋亡以及细胞周期调节中发挥的作用；探讨TIM的活化或阻断对T细胞的免疫活化与细胞耐受的关系。4. 应用脂类代谢组学方法，确定移植物慢性失功发生过程中重要脂类代谢网络的异常改变。5. 随访受者了解HBV复发情况；研究IL15促进pAAV/HBV1.2 小鼠肝再生的机制。6. 应用动物模型研究移植肝微环境对肝癌复发的影响及其免疫调控途径；通过肝癌患者血清和组织中的差异蛋白及其生物学功能，筛选同肝癌肝移植术后复发高度相关的候选基因；研究RNAi纳米载体系统的控释技术。7. 观察免疫抑制状态下肠黏膜上皮病理及屏障功能变化；研究器官移植受者免疫细胞的数量、比例及表型变化。8. 考察免疫抑制剂药动学的与遗传因素的关系；建立免疫抑制剂药物暴露量监测方法；观察比较细胞因子浓度和谱系的变化；比较不同免疫抑制方案下肝癌肝移植受者的肿瘤复发、转移及排斥反应发生情况，J2联用其它淋巴细胞活化阻断剂，对移植模型药物治疗效果。9. 研究具有不同亲合力的抗同种抗原T细胞株，探索改造体内抗同种抗原T细胞群体的亲合力组合的实验途径。1、 确定器官移植过程中MIC上调表达的主要诱导因素的主要分子，筛选促纤维化因子的拮抗分子。2、 建立中国汉族人群HLA-A, B,C,DRB1及DQB1等位基因频率资料库；获得HLA基因重组事件家系低精度遗传图谱。3、 明确选择性阻断TIM对慢性排斥反应的防治作用的效果，寻找阻断T细胞活化抑制器官移植排斥的新途径；4、 构建移植物慢性失功发生过程中重要脂类异常改变的代谢网络。5、 发现HBV复发规律，对预防方案进行综合评价；明确IL15在小鼠肝细胞再生中的作用。6、 揭示肝癌肝移植动物模型中移植术后供肝微环境改变与肿瘤复发的相关性；确定对肝癌复发转移具有预测价值的蛋白；筛选、确定优化的纳米粒制作、修饰方法。7、 探讨肠上皮结构和功能的改变与免疫抑制状态下感染发生、发展的规律；.初步明确器官移植受者对粘膜局部淋巴系统的影响；建立器官移植受者感染的诊治标准。8、 初步确立移植受者口服免疫抑制剂的群体药动学参数；建立判断受试者的免疫状态数学模型；获得最合适的联合用药方式。9、 建立具有不同亲合力的抗同种抗原T细胞株。10、 发表SCI论文1