遗传学实验_甜蜜素对蚕豆微核形成的影响.doc

诱变物质的微核检测技术摘要 通过使用不同浓度的甜蜜素对蚕豆和大蒜进行培养，以检测甜蜜素的毒性强弱。1.引言微核：间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。微核是染色体畸变的一种表现方式。引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。物理因素包括：具有能量的各种射线，如射线，射线，射线，X-ray，中子，质子，UV等。化学因素包括：诱变剂和重金属等。经典断裂剂：射线。诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。微核技术获得的结果与通过中期畸变染色体计数所获结果相当。甜蜜素，其化学名称为环己基氨基磺酸钠 ，是食品生产中常用的添加剂。甜蜜素是一种常用甜味剂，其甜度是蔗糖的3040倍。消费者如果经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其他食品，就会因摄入过量对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。1甜蜜素在人体内不能被新陈代谢，但肠内细菌可使之降解为环己胺，而环己胺是致癌物质。1969年，有人报道，其对大鼠可诱发膀胱癌，该试验也获得了日本有关部门的认可，美国FDA禁止其加入食品或作为食品添加剂。孟加拉国在2007年开始禁止使用甜蜜素作为食品添加剂。而欧盟也在2000年和2003年两次调整甜蜜素的最高限定值。而我国至今仍然没有调整甜蜜素的限定值，其已经超过欧盟限定值的2.5倍。美国FDA明文禁止我们使用甜蜜素。至今世界上明确准用的有中国、欧盟、德国等80多国；而明确禁用的有日本、美国等45 国。22.实验材料2.1实验材料大蒜，蚕豆，甜蜜素，0.1mol/L NaN3，1mol/L盐酸,酒精，乙酸，水，纱布，培养皿，改良苯酚品红,载玻片，盖玻片，解剖针，显微镜，刀片。2.2实验方法2.2.1材料的获取及处理取材：大蒜：于24 水中浸泡24-36 h,选择根长整齐一致，不定根长约0.51cm左右的大蒜随机分组。 蚕豆：于24 水中浸泡36 h,湿纱布包裹催芽36 h,选已发芽的蚕豆放入垫有湿脱脂棉的培养皿中培养36 h,每12 h用水冲洗1次,换水培养。选择根长整齐一致,根长约1.01.5 cm的蚕豆随机分组。培养：将蚕豆、大蒜分别分为五组，分别用水、0.175g/ml甜蜜素、1.7510-2g/ml甜蜜素、1.7510-3g/ml甜蜜素和叠氮化钠培养。用40mmol/L的叠氮化钠培养大蒜，用20mmol/L的叠氮化钠培养蚕豆。同时同条件培养24小时。之后清水恢复培养24小时，用卡诺固定液最后固定24小时，再用70%的乙醇4下保存。解离：固定后的材料用清水洗涤后，大蒜用1MHCl处理10min，水洗三次；蚕豆28下根尖用5MHCl 处理25-50min, 水洗3次。在酸解过程中一定要掌握好温度和时间，若解离不够，则压片不易分散。若解离太过，在下一步处理材料时由于材料过软而易丢失。然后水洗3次。染色：大蒜切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染色10min。蚕豆切取近根尖分生区的伸长区组织，捣碎，用改良苯酚品红染色20 min。2.2.2染液的制备改良苯酚品红，其制备过程如下：原液A 3g碱性品红溶于100ml 70%乙醇中。原液B 取原液A 10 ml加入90 ml 5%的苯酚水溶液。取原液B 45ml加入6ml 冰乙酸和6ml 37%的甲醛。（适合于植物原生质培养中的细胞核染色）取2-10ml染色液，加90-98ml 45%的醋酸1.8g山梨醇。（适合于细胞核的染色，只有细胞核及染色体被染成紫红色，而细胞质不着色）2.2.3制片及镜检压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。镜检：每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。3.结果0.175(203g/kg)甜蜜素由于浓度过大，导致细胞脱水死亡，蚕豆、大蒜都未能成功存活。蚕豆中其他组可能由于处理时解离时间不充分，以及染色时间不足未能成功染色，造成无法观察细胞结果。实验失败。大蒜组实验结果良好：培养溶液(g/ml)水1.7510-3(2.03g/kg)甜蜜素1.7510-2(20.3g/kg)甜蜜素0.175(203g/kg)甜蜜素40mmol/L的叠氮化钠微核率（）01030死亡比率并不是很大表格 1 大蒜组微核实验结果图表 1 GB 2760-2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准3由上表可知，液体类食品中，甜蜜素的最大使用量为0.65g/kg。试验中浓度最低为2.03g/kg，其微核率为10,有效最高浓度为20.3g/kg，相对应的微核率为30，根据“微核发生率同作用因子的剂量呈正相关”，由此估算，液体类食品中，当其浓度为0.65g/kg时，其微核率为0.71。因此由实验结果推断，在正常使用甜蜜素的情况下，其有可能会对细胞造成一定程度的轻微损害。4.讨论 微核监测的关键：（1）材料的选择应选择染色体条数少，个体大，便于统计，对污染物反应比较敏感的材料，应适宜于在当地生长。在微核试验（MNT)中经常使用的小鼠品系CD-1、BDF1、ddY、MS/Ae系(小鼠是由瑞典学者Aeschbacher建立的对诱变作用高度敏感的新品系)。（2）材料的处理不同药剂处理的同一植物，当它们达到产生微核的峰值后，由于长时间处理所诱发的微核数之间的差异会变得不显著。同一处理，同一剂量下短时间处理能达到微核的峰值，长时间处理仍只能得到相似的峰值微核值的趋势。因此应通过试验找出最佳处理时间，这样不仅可大大缩短实验周期，而且可使实验结果更加明显、可靠。（3）微核的统计微核的识别标准：主核大小的三分之一以下的小核，不论深浅，形态可以是圆形，椭圆形，不规则形，可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓楞楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心(Chromocenter)当作微核计入。参考资料1 /view/140319.htm 甜味