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文档简介
分子刺激朊蛋白质的转化很多证据支持这一假设的传染病的代理人朊病毒病是缺乏核酸,而是由一个特定的传染性蛋白。这种蛋白,朊病毒,似乎是由模板诱导构象变化的正常表达蛋白,朊(参考文献2)。虽然有无数的研究已经建立的转换X朊病毒作为中央致病事件的朊病毒疾病,它是未知是否之外的其他因素可能是基因的细胞为了促进有效的朊病毒蛋白生产。我们调查生物化学放大抗蛋白酶的prpsc-like蛋白(具有)使用一种修改台的可循环扩增method4。在这里,我们报告,计量转换X具有体外需要具体核糖核酸分子。值得注意的是,而哺乳动物核糖核酸制剂具有刺激体外扩增,核酸准备从无脊椎动物物种不。我们的研究结果表明,编码的刺激分子可能有作用的朊病毒疾病的发病机制。他们还提供一个实用的方法提高诊断的灵敏度技术的基础上具有放大。我们以前表明,具有体外扩增股份许多具体特点与致病过程中的朊病毒传播在体内,包括应变和物种specificity3。在一个典型的扩增反应,稀释的朊病毒感染的脑组织匀浆(0.1%瓦特/五)和5%(瓦特/五)正常脑组织匀浆或缓冲控制和培养一夜之间在37转到。仓鼠sc237具有放大约6倍,在这些条件下(图1,comparemwith律师)。而生化特征要求具有放大的反应,我们惊讶发现治疗的反应dnase-free,异构胰腺核糖核酸酶废除具有放大剂量依赖的方式(图1,第一面板)。在体外具有放大还废除治疗与纯化核糖核酸酶,核糖核酸酶,微球菌核酸,或benzonase(图1)。在控制实验中,我们发现,除了核糖核酸酶1小时后,一夜之间孵化并没有减少恢复已具有放大(补充图中)。相比之下,具有放大并不受此酶,这降低双链核糖核酸molecules5(德尚),或核糖核酸酶,其中特别劈开脱氧核糖核酸核糖核酸:hybrids6(图1 b,第一和第二板)。两者合计,这些结果表明,单链(不锈钢)是需要具有放大在体外,但双链RNA和核糖核酸:核酸杂交不。加入酶或限制性内切酶酶切并没有减少具有放大,显示是不需要的过程(图1 b,第三和第四小组)。此外的酶磷酸双磷酸酶与肝素三也没有影响具有放大,这意味着既高能核苷酸和分子含有硫酸乙酰肝素所需的具有放大在体外(图1 b,第五和第六小组)。在控制实验中,我们证实了退化的目标分子的每一个这些反应混合物通过使用适当的分析测定这些结构(补充图二)。确保商业酶制剂使用没有污染的蛋白酶,我们的水平来衡量的成立后,隔夜孵化与具有各种核酸。这些测量证实的基因(图2)和输入具有(图乙)均不受干扰的增加酶的抑制具有放大。作为一个控制确认废除具有放大取决于刺激活性的抑制核酸,我们增加了benzonase,微球菌核酸和核糖核酸酶一具有扩增反应的酶不活跃状态。双方benzonase需要二价阳离子和微球菌核酸酶活动,所以我们灭活这些核酸增加5毫米乙二胺四乙酸。活性位点的酶acontains关键的组氨酸残基可以共价修饰的焦碳酸二乙酯(乙酯)。因此,我们处理的核糖核酸酶抑制核糖核酸酶乙酯活动,和删除多余的乙酯透析。我们的研究结果表明没有这三个核酸扩增的抑制具有无效的国家,支持这一假设的完整核糖核酸分子推动这一进程(图2)。要测试是否抑制具有扩增可能是介导的最终产品的核糖核酸酶消化,我们直接测量影响循环20,30-guanidine磷酸(鸟苷)和30磷酸胞苷(中医)上具有放大。既不这些核苷酸抑制在体外具有放大浓度为1毫米(图2)。我们的控制实验排除可能性污染蛋白酶,位阻,或消化产物帐户的抑制具有扩增的特异性核酸酶。两者合计,这些实验表明,核糖核酸是需要具有放大在体外。我们试图确定是否分离制备核糖核酸分子可以重建能力nuclease-treated正常脑组织匀浆放大具有。值得注意的是,总核糖核酸分离仓鼠大脑成功重组的benzonase-pre-treated脑匀浆放大能力具有以剂量依赖的方式(图3)。相比之下,纯化硫酸乙酰肝素蛋白多糖(多糖)未能重建具有扩增(图3)。其他阴离子,如单链DNA(图3),多聚腺苷酸,硫酸乙酰肝素,戊聚糖聚谷氨酸和硫酸酸(数据未显示)也未能刺激具有放大。在这个和其他重建实验,benzonase治疗控制车道有更大程度的具有放大比稀释痒病脑匀浆控制样品,表明,benzonase预处理反应是不完整的。根据经验,我们发现,它是必要的执行benzonase预处理反应在4控制避免变性成立后加入阴离子。估计分子大小的核糖核酸物种能够重组具有放大,我们分割的制备总仓鼠脑核糖核酸超滤通过滤波器的相对分子量截止约100000(先生10万)。用琼脂糖凝胶电泳,我们发现所有的核糖体核糖核酸带的截留和所有的转移核糖核酸滤液(数据未显示)。使用这些样本,我们发现该过滤器截留能力再造具有放大一个水平略低于普通全脑核糖核酸。相比之下,滤液无法重建具有扩增(图3)。这些数据表明,大多数的重建活动是由10万分子。(300个核苷酸大小。)。目前有一个需要制定更敏感的诊断检测朊病毒这种可能实现的增加效率具有放大技术。因此我们研究是否增加脑核糖核酸可以增加总的仓鼠具有效率的体外扩增核酸大脑样本不前。我们混合更稀匀浆朊病毒感染的脑(0.02%瓦特/五)5%(瓦特/五)正常脑匀浆一夜之间没有超声测量,具有放大。我们的结果表明,除了总仓鼠大脑核糖核酸混合物的完整的脑组织匀浆明显刺激具有放大超过基线(图4)。作为一个控制,我们确认,除了核糖核酸并没有改变的输入具有或基因在这些样本(补充图三)。光密度测量表明,具有0.02%(瓦特/五)prioninfected脑匀浆样品扩增后约6倍一夜之间孵化,类似于具有放大级以前的报告0.1%(瓦特/五)homogenate3朊病毒感染脑。相比之下,具有样品中扩增核酸扩增大约24倍,这表明增加核酸增加了效率在体外具有放大四倍。除了核糖核酸也提高了效率,具有放大声振蛋白质错误折叠循环扩增(扩增技术)反应(补充图四)。评估的特异性RNA介导的刺激具有扩增,我们孤立核糖核酸从几个来源,包括大肠杆菌,酿酒酵母,线虫线虫,果蝇,小鼠和仓鼠大脑和。琼脂糖凝胶电泳分析这些制剂显示预期乐队模式为每个物种确定了制备包含高品质,退化的核糖核酸(条)。此外,所有这些准备工作大大免费的污染物判断的光学光谱(A 260/280。1.9条;表明吸收和下标数字表示波长)。值得注意的是,在筹备工作的六个核糖核酸测试,只仓鼠和小鼠脑核糖核酸具有刺激体外扩增(图4)。这种明显的物种特异性不能归咎于组织特异性,因为总仓鼠肝核糖核酸也刺激具有放大(数据未显示)。这认为,小鼠仓鼠表达特定核酸分子所需要的具有放大。更多的试验表明,核糖核酸刺激活动在trizol-extracted仓鼠脑核糖核酸制备是不可逆转的破坏glyoxylation,但不脱蛋白,加热到60跑车,或短暂暴露于50%甲1小时(补充图五)。如果具有放大研究准确模型朊病毒形成在体内,这里提出的结果是一个重大的进展我们的理解机制的朊病毒转换。以前的,它已经表明,纯化基因可以转换为蛋白酶抗性具有体外的情况下细胞cofactors7。然而,事实上,50倍摩尔过量的纯化具有驱动所需转换纯化基因表明高效的具有形成可能取决于存在细胞其他因素比X(参考文献8)。结果的基础上提出的在这里,我们提出的假设,具体核糖核酸分子细胞辅助因子朊病毒形成。符合我们的假设特定rna-converting因素刺激朊病毒形成,核酸结合添置和促进构象变化的重组蛋白(参914)。然而,这是很重要的注意,全长,复性重组蛋白缺乏翻译后修改不能接受计量转换对具有(补充图六),因此结果生物物理研究利用重组蛋白不能直接相关的结果描述这里。有人建议,朊病毒分子可以绑定到特定主机的核糖核酸分子diversity15产生应变。是否rna-converting因素描述也在参与生成应变多样性仍然确定。最后,重要的是要强调的存在rna-converting因素是完全符合蛋白质只有假设提出previously1,因为核酸我们描述编码和酸不包含在传染性剂。方法动物和试剂来源特定病原体无女性叙利亚金黄地鼠在3周龄的购买查尔斯河实验室。磷酸双磷酸酶,乙酯,环20,30-gmp,30-cmp,肝素三,硫酸乙酰肝素蛋白多糖(先生。20万),多聚腺苷酸(先生200白)和聚谷氨酸(50K)获得了西格玛rnase-free酶,微球菌核酸和核糖核酸酶,核糖核酸酶dnase-free获得罗氏;核糖核酸酶T 1是从震中;重组benzonase核酸购买组织;酶切获得试剂盒;和rnasehand核糖核酸酶1获得了从ambion。在体外具有放大在体外具有amplification3和pmca4进行如前所述,除正常脑组织匀浆准备与edta-free完整蛋白酶抑制剂(罗氏)促进实验涉及金属依赖性酶。2毫摩尔的氯化镁加入反应benzonase和2毫米氯化钙添加到反应与微球菌核酸酶和磷酸双磷酸酶。所有放大和控制反应分别在37笼16小时为具有检测,蛋白酶进行消化50mgml21蛋白酶K为1小时,37控制和免疫印迹进行3f4单克隆抗体(纹章)。对基因的检测,样品不受蛋白酶K消化前免疫。蛋白质电泳实验显示出对12%进行了聚丙烯酰胺凝胶和参考磁共振等实验证明。核酸酶失活微球菌核酸和benzonase抑制5ED TA。核糖核酸酶(50毫克)孵育1%乙酯在100毫升258c2小时后孵化,反应透析两次1升10mmtrisPH值7.2在4控制使用皮尔斯3500mwslide-a-lyzerminidialyis单元删除免费乙酯。控制样品中含有活性酶是透析平行。蛋白质回收。90%证实了基本能力评估试验(皮尔斯)。积极的和灭活核酸扩增反应浓度增加图1中指定的。“没有酶的控制样品进行平行处理。重组实验核酸酶消化前重建是由孵化一批正常脑组织匀浆(10%瓦特/五)与benzonase(终浓度为2.5uml21)和2毫米氯化镁为16小时,4控制在没有洗涤剂。benzonase当时灭活的另外5ED TA之前重建与核糖核酸或其他阴离子的。制备及测量核糖核酸核糖核酸分离的动物,5分钟后死亡使用转子定子同质化,用Trizol试剂提取(公司)为5分钟25跑车,和异丙醇降水量根据制造商的指示,使用rnase-free试剂,容器和设备。酵母细胞壁被破坏,在提取先前描述,使用试剂代替phenol16。所有的核糖核酸的解决方案是酒精洗涤沉淀,悬浮在rnase-free水使用。浓度和纯度的每个解决方案是确定的光谱吸收的测量在一楼/2260 /280纳米和经1%琼脂糖凝胶电泳染色溴化。核糖核酸大小分馏总仓鼠脑核糖核酸(0.4毫克)稀释到0.8毫升rnase-free水,装在0.2毫升批次到四个单独的施莱谢尔和许尔交换机uf-05(K截止)超滤装置,离心15 min在三零零零克的设备清洗。与同等体积的水。滤液汇集和截留分数收集通过离心超滤装置倒成新离心管。平行样变性截留准备在50%甲破坏所有内部和分子间的相互作用。逆转录聚合酶链反应逆转录聚合酶链反应采用一步法核糖核酸聚合酶链反应试剂盒(逆转录)从宝/渔船下列制造商的指示,使用蛋白的具体50-cgaacc引物ttggctactggctgctg-30和50-gcttgatggtgatattgacgcagtc-30,和以下参数:反转录在50笼15分钟,热灭活逆转录酶在94笼为2分,25循环(94控制30,55控制30,72简介90秒)。经营范围是运行在1%琼脂糖凝胶染色溴化。七月七月接受收到的4;31:2003;10.1038/nature01979。Figure 1 Effect of various enzymes on PrPres amplification. Immunoblots of PrPresamplification reactions. Samples include mixtures of normal and diluted scrapie brainhomogenate (M), diluted scrapie brain homogenate control (Sc), and mixtures of normaland diluted scrapie brain homogenate incubated with various enzymes in a dilution series.The values of X (manufacturers U ml21) for enzymes are: DNase-free RNase . 0.5;RNase A . 0.005; RNase T1 . 50; micrococcal nuclease . 0.005; benzonase . 2.5;RNase V1 . 0.01; RNase H . 1; RNase-free DNase . 1; EcoRI . 1; apyrase . 0.1;heparinase III . 0.025.Figure 2 Nucleases do not cause proteolytic, steric or end-product inhibition of PrPresamplification. a, Effect of DNase-free RNase on PrPC levels. Standard amplificationmixtures were incubated overnight with RNase. Serial dilutions of each sample are shown.b, Effect of nucleases on PrPres levels. Samples of diluted scrapie brain homogenate weretreated with specified nucleases at concentrations designated X in Fig. 1. c, Effect ofinactivated nucleases on PrPres amplification. Samples include mixtures of normal anddiluted scrapie brain homogenate (M) and diluted scrapie brain homogenate control (Sc).d, Effect of nucleotides on PrPres amplification.Figure 3 Reconstitution of PrPres amplification with RNA. Immunoblots of PrPresamplification reactions. Samples include mixtures of normal and diluted scrapie brainhomogenate (M) and diluted scrapie brain homogenate control (Sc). Indicated sampleswere pre-treated with benzonase before reconstitution assays as described in Methods.a, Reconstitution with total hamster brain RNA or HSPG. b, Reconstitution with0.5 mg ml21 total hamster brain RNA or 0.5 mg ml21 random, synthetic 23-base DNAoligonuc
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