《科研仪器学》.doc

名解1、流式细胞术：利用流式细胞仪，对处于快速直线流动的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性定量分析、分选的技术。2、生物芯片（DNA芯片或基因芯片）：DNA杂交探针技术与半导体工业技术相的结合。将大量探针分子固定于支持物上后与带荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。3、RCF（相对离心力）：在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是“g”。4、冷冻干燥冷冻干燥（以下简称冻干）就是将含水物质，先冻结成固态，而后使其中的水分从固态升华成气态，以除去水分而保存物质的方法。5、冻干曲线将搁板温度与制品温度随时间的变化记录下来，即可得到冻干曲线。比较典型的冻干曲线系将搁板升温分为两个阶段，在大量升华时搁板温度保持较低，根据实际情况，一般可控制在-10至+10之间。第二阶段则根据制品性质将搁板温度适当调高，此法适用于其熔点较低的制品。6PCR技术PCR技术又称为聚合酶链式反应，其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理，体外合成目的DNA片段的方法。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。7RT-PCRRT-PCR指逆转录PCR, 是指从RNA或mRNA直接扩增获得目的DNA片段的过程.8荧光定量 PCR通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。9分子筛层析技术凝胶颗粒内部呈网孔状结构，分子质量大的蛋白质难以进入凝胶颗粒内部，主要从凝胶颗粒的间隙里通过，所受阻滞作用小，所以大分子蛋白质迁移速度快，先流出凝胶 。分子质量小的蛋白质则容易进入凝胶颗粒内部，所受阻滞作用大，所以小分子蛋白质迁移速度慢，后流出凝胶，从而将分子质量大小不同的蛋白质分开。10离子交换层析技术：蛋白质是两性分子，在一定的pH条件下带有电荷，不同的蛋白质所带有电荷的种类和数量不同，因此它们与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。这样，当蛋白质混合物流经带电凝胶时，电荷吸引作用小的蛋白质先流过，而电荷吸引作用大的蛋白质后流过凝胶，从而把不同的蛋白质分开。 11吸附层析技术由于不同的蛋白质所含有的氨基酸的种类和数目不同，分子表面的极性氨基酸 和非极性氨基酸的数目、分布区域不同，因此它与分子比表面积大的吸附剂间的相互作用力大小不同。根据此原理对蛋白质进行分离纯化。 12蛋白质组学蛋白质组(proteome)是指基因组表达的全部蛋白质及其存在方式。13双向电泳技术第一向: 等电聚焦（IEF）：等电聚焦是利用蛋白质分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线形pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。第二向:SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE电泳是根据SDS和还原试剂将蛋白质分子解聚后亚基的大小，在恒定的pH缓冲系统中的分离。经过双向电泳能将蛋白质在一个二维平面分开。14生物质谱技术质谱技术是蛋白质组学研究中最为广泛使用的蛋白质鉴定技术。其基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比（M/Z）的差异来分离并确定分子质量。质谱技术能从复杂的样本中定性、定量分析蛋白质，其灵敏度高，可达到fmol(10-15)乃至amol(10-18)，速度快，现已经成为蛋白质组研究中主要的蛋白质鉴定技术。15肽质量指纹图谱MALDI-TOF-MS常用于蛋白质的肽质量指纹图谱(peptidemass finger printing，PMF)鉴定。PMF是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹图谱(finger printing)。16基质辅助离子化技术试样溶解或悬浮于基质中，激光束辐射到基质和试样分子上。基质吸收激光束能量后汽化，部分试样分子伴随基质的汽化而解吸。基质吸收大部分激光能量，减少了试样分子被激光能量破坏及过度电离成碎片离子。17核酸分子杂交 把亲源关系较近的，不同生物个体来源的变性DNA或RNA单链，经退火处理形成DNA-DNA或DNA-RNA这一过程叫分子杂交。18Southern 印迹杂交原理基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶上DNA经变性后，转印至尼龙膜上，用带有标记（放射性，萤光）目的基因作探针与之杂交，经放射自显显，检测是否含有与探针互补的DNA序列。19Northern印迹杂交细胞或者组织的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，并将凝胶上RNA转印至尼龙膜上，用带有标记（放射性，萤光）目的基因 或其互补RNA作探针与之杂交，经放射自显影，检测是否含有与探针互补的mRNA序列。所以与Southern blot， Northern blot是mRNA与互补的单链DNA或 RNA杂交。 20Western blot(蛋白质印迹技术)的原理首先将蛋白质用聚丙烯酰胺凝胶电泳按分子大小分开，再将蛋白质转移到尼龙膜或其他膜上，用抗体作为探针与之杂交，反应之后用放射自显影或底物显色来检测是否与抗体特异性结合的抗原。 与DNA和RNA不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成，反应时用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记第二抗体， 填空1、使用流式细胞仪检测细胞周期、细胞DNA、RNA含量、总蛋白质含量用（线性）放大器，检测细胞表面表面抗原、膜受体分布（对数）放大器。2、影响DNA测序的因素：模板的影响、循环测序反应条件、电泳的影响。模板的影响：模板DNA不纯；定量不准；难测模板循环测序反应条件：引物的影响；富含GC的模板电泳的影响3、染色细胞核的染料：Hoechst33258（蓝）、DAPI（蓝）、FITC（绿）、Propodium Iodide（红）、CY3（红）。4、细胞融合的方法（电融合、聚乙二融合醇、病毒融合）。5、激光共聚焦显微镜的原理是利用（一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光）的成像。6、细胞穿孔的方法（电穿孔、磷酸钙沉淀法、激光钻孔法、微射弹法）。7、酶标仪中的光学检测方法（光度测定、荧光、时间分辨荧光、荧光偏振、化学发光）。8、DNA测序的主要方法（新生链的荧光标记、双脱氧末端终止法）。9、用于提取纯化生物大分子理化性质的离心机（分析性离心机），用于实验的（制备型离心机）。10、流式细胞术前向散射（FSC，小角散射），大小与细胞直径成正比，细胞越大，FSC越大；侧向散射（SSC，90散射），与细胞内颗粒结构的质量成正比，胞内颗粒结构越复杂质量越大，SSC越大。11、Ca2+荧光指示剂包括：Fura-2、indo-1、Quin-2。12、全自动DNA测序仪主要包括电泳系统、激光器和荧光检测系统 ；大致可分为自动进样器区、凝胶块区和检测区等结构功能区。13、全自动DNA测序仪根据电泳方式的不同分为平板型电泳和毛细管电泳两种仪器类型14、DNA测序过程包括：分离纯化模板DNA、DNA模板定量分析、测序反应、测序反应后纯化、on-line变性、毛细管电泳和检测和数据分析。15、DNA测序过程中，用荧光标记新生链时，分为多色标记法和单色标记法；根据标记部位不同，又分为荧光标记引物法和荧光标记终止底物法。16、激光共聚焦显微镜由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成。17常规PCR技术包括变性、退火、-延伸三个基本反应步骤。18常规PCR反应体系由缓冲液、模板DNA、引物、4种脱氧核糖核苷三磷酸、TaqDNA聚合酶和Mg2+组成。19蛋白质的分离纯化方法中，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的。20蛋白质的分离纯化方法中，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是依据不同蛋白质带电性质不同来分离纯化蛋白质； 21蛋白质细分级方法有分子筛层析、离子交换层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向电泳、毛细胞电泳、 等电聚焦电泳等22蛋白质粗分级方法有硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超速离心、等电点沉淀、透析、超滤等。23蛋白质组研究核心技术包括蛋白质分离技术 (如双向电泳和多维液相层析)、蛋白质鉴定方法 (如氨基酸序列分析和质谱技术）和生物信息学技术。24质谱仪关键部件是离子源和质量分析器是两个关键的部件。其中质量分析器决定着质谱的准确度、灵敏度和分辨率等。25核酸分子杂交探针标记有同位素和非同位素标记两种，其中，非同位素标记物主要有生物素、地高辛配体、荧光素等。简答1 PCR的原理DNA在高温时也可以发生变性解链，当、温度降低后又可以复性成为双链。通过温度变化控制DNA的变性和复性，设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，可完成特定基因的体外复制。高温变性，低温退火，适温延伸2 流式细胞术的特点。1、实现对单列细胞的检测2、实现高通量检测3、多参数、多色荧光分析使对细胞识别技术更精确4、可定性定量分析细胞5、分选特定功能、性状的细胞3 电穿孔仪与细胞融合仪的基本原理。电穿孔仪：细胞膜基本上是一绝缘体，膜两侧浸在含离子的电解质溶液中，在外加电场时，膜两边的电解质离子极化，形成外加膜电位差。高压电脉冲击穿细胞膜后，磷脂双分子层和细胞膜均可复原。细胞膜的复原不但与脂肪分子的排列和相互间引力有关，还与其他重要因素有关，如胶体渗透作用、溶液离子作用和膜蛋白的影响等。细胞融合仪：通过非均匀电场的电介质电泳作用，建立细胞(原生质体)间的紧密接触，形成细胞串。再利用高压脉冲的可逆击穿效应使接触区质膜上形成微孔，胞质通过微孔融合。4 流式细胞仪的构成模块。流动室与液流系统、光源与光学系统、信号收集与信号转换系统、计算机与分析系统、分选系统。5 荧光检测酶标仪的主要模块。1、一个激发光源（卤素灯氙灯、激光）2、荧光色团 (染料)3、波长选择元件：滤光片对或光栅(区分激发光和发射光）4、检测发射光的检测器 (光电倍增管, PMT)6 超速离心机的主要使用注意事项。1、离心前预冷转子2、超速离心时，液体一定要加满离心管，避免离心管变形3、离心后清洁离心机腔体和转头，并擦干腔内冷凝水，打开门，直至腔内恢复常温7简述影响点穿孔仪和细胞融合仪的因素。1、采用指数型衰减波优于使用方形波2、达到临界电压，否则无法击穿细胞膜3、对于细菌由于有外膜，临界电压需要加大12个数量级。8分光光度计理想的光源条件是：1、提供连续的辐射；2、光强度足够大；3、在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；4、光谱范围宽；5、使用寿命长，价格低。9、双脱氧链末端终止法的原理：其原理是利用DNA的体外合成过程，但与普通PCR不同的是，双脱氧链末端终止法测序反应中除有-脱氧核苷三磷酸（dNTP）外，还加入2-双脱氧核苷三磷酸（2-ddNTP），由于没有-OH，不能进行后续反应，使正在延伸的DNA链在此终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段，通过电泳分离后可读出新生DNA链的序列10简述荧光定量 PCR定量原理及计算方法反应最初，虽然产物是指数增长,但是荧光处于背景水平，检测不到荧光增加.当累积了足够的扩增产物，可以产生可检测的荧光信号时，这个循环数叫初始循环数，即CT。由于CT值处于指数期内，这时的反应成份不会抑制扩增反应进行，因此荧光定量PCR结果是可靠的，可以准确地反应体系中模板的初始量。如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2n=稀释倍数“决定； n为阈值线上扩增曲线之间的循环数（CT的差值）例如：10倍稀释的DNA样品， 2n=10 因此n=3.32，即CT值相差3.32个循环。11荧光定量PCR的应用（1）实时监测产物量，计算初始模板量（2）基础研究的基因表达分析研究（3）临床病原体检测 病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌 （4）食品卫生检疫 a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针 b.食品中病原微生物的检测 12蛋白质分离纯化与鉴定的主要步骤 （1） 选择实验材料（2） 实验材料的预处理 （3） 蛋白质的提取 （4） 蛋白质粗分级 （5） 蛋白质细分级 （6） 蛋白质的鉴定 13蛋白质鉴定的相关要素（1）蛋白质分子质量（2）等电点（3）氨基酸组成及其顺序（4）免疫特性（5）结晶特性（6）生物学功能14核酸分子杂交技术的原理有互补特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起时，其相应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用合适标记物（如放射性同位素、生物素等）予以标记，当作探针（probe), 与变性后的单链基因组DNA或RNA进行杂交。再用合适方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标记物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表达丰度等。15Southern blot的步骤：（1）基因组DNA的提取（2）限制性内切酶酶切（3）. 琼脂糖凝胶电泳（4）. 转膜（5）. 与探针杂交（6）. 洗膜（7）. X射线胶片显影16缺口平移法的原理 将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。 首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。问答1、激光共聚焦显微镜相较于普通显微镜的优势在哪里；此外，请简述激光共聚焦显微镜的应用。 激光共聚焦显微镜能够形成完全聚集的3D样本图形。定位不同的荧光染料在3D样本图形中的着色位置。精确测量二维、三维平面及空间结构。具有识别空间位置的能力从而进行三维坐标定位。节省标本处理时间很少需要进行样本包埋用显微切片。应用：1、检测被一种或多荧光染料标记的样本2、检测样本荧光着色位置或其他特征3、完整观察新鲜或固定样本内部结构4、在活细胞或组织中描绘标记离子的荧光染料5、全程监控GFP转染后的细胞或组织2、冷冻干燥机的工作原理及对冻干制品的质量要求。 冷冻干燥机的工作原理是将被干燥的物品先冻结到三相点温度以下，然后在真空条件下使物品中的固态水份（冰）直接升华成水蒸气，从物品中排除，使物品干燥。物料经前处理后，被送入速冻仓冻结，再送入干燥仓升华脱水，之后在后处理车间包装。真空系统为升华干燥仓建立低气压条件，加热系统向物料提供升华潜热，制冷系统向冷阱和干燥室提供所需的冷量。 本设备采用高效辐射加热，物料受热均匀；采用高效捕水冷阱，并可实现快速化霜；采用高效真空机组，并可实现油水分离；采用并联集中制冷系统，多路按需供冷，工况稳定，有利节能；采用人工智能控制，控制精度高，操作方便。 对冻干制品的质量要求是：生物活性不变、外观色泽均匀、形态饱满、结构牢固、溶解速度快，残余水分低。要获得高质量的制品，对冻干的理论和工艺应有一个比较全面的了解。冻干工艺包括预冻、升华和再冻干三个分阶段。合理而有效地缩短冻干的周期在工业生产上具有明显的经济价值。3、分光光度计吸收池的使用注意事项： 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：A= A1-A0 高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。其他重要附件：高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。4、如何使用荧光检测技术对细胞凋亡进行检测：Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。设计出荧光物质偶联的短肽Z-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定 caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。5、如何使用分光光度计对核酸进行定量。核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1 OD 的吸光值分别相当于50g/ml的dsDNA，37g/ml的ssDNA，40g/ml的RNA，30g/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。6、荧光标记引物法和荧光标记终止底物法的异同点。1、都确定了4种荧光染料与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的专一对应关系2、荧光标记引物法使荧光有色基团标记在长短不同的DNA片段的端，可理解为荧光染料标记过程和延伸反应终止分别发生在同一DNA片段的两端，且标记发生在引物与模板的退火过程中，而终止是发生在片段延伸过程中，两者在时间上有一定间隔3、荧光标记终止底物法使标记和终止过程合二为一，两者在同一时间完成 4、在具体操作中，前者要求A、C、G、T四个反应分别进行，而后者的四种反应可以在同一管中完成 7、请比较蛋白质与DNA测序过程的异同点。蛋白质测序DNA测序测序中判断的复杂性20种氨基酸且可能出现特殊的氨基酸4种核苷酸样品的性质不同蛋白质和肽片段理化性质相差很大，存在不溶性和变性的问题不同DNA片段理化性质相差小，基本不存在不溶性和变性的问题对样品量的依赖性常为主要限制因素只要建立了克隆，样品量不成问题测序速度手工操作者一天完成约4-5个残基的顺序，自动测序仪一天可完成约30个残基的顺序手工操作一天可完成数百个碱基的顺序，自动测序仪一天可完成数千碱基的顺序测定准确性常出现拼接和辨读错误准确性高费用高，对昂贵的仪器依赖性强较低，手工方法可满足一般测序要求8、影响电穿孔仪和电融合仪效率的因素(1) 电脉冲的幅度、时间和脉冲波形使细胞膜不稳定而被击破的最低电压称为临界电压。大致上14 kV/cm的电场加在半径为10 m的动物细胞上，即可产生膜的临界电压。植物细胞必须先把细胞壁去掉，剩下的原生质体的穿孔和融合所需电压与动物细胞相近；细菌的外膜相当强韧，所需临界电压也往往比普通动物细胞高12个数量级。脉冲的幅度只是要求条件之一。脉冲的宽度也必须比膜的充电时间和膜的弹性复原时间长，这样才能保证孔道在脉冲以后有机会继续开放一段时间。一般来说，宽度窄的脉冲，需要高幅度来弥补。太宽的脉冲往往会击破融合区外的细胞膜，导致细胞死亡，交流脉冲或多次脉冲能够充分利用脉冲电场的相向电泳压力，所以往往比单个直流(方形)脉冲有效。如果穿孔用的电脉冲，在以峰电压击破细胞膜后能以较低的电压维持孔道的短时间开放，则对提高穿孔效率有益，因此指数衰减的脉冲往往比同能量的方形脉冲有效。专门设计的脉冲形也许会比指数衰减形更有效，但指数衰减波形的脉冲最易制造，所以用途最广。(2) 胶体渗透压和细胞膨胀细胞被脉冲击穿之后，水和一些离子可以自由进入，但大分子却不易通过击穿的小孔。由于渗透压的不平衡，水、部分离子和小分子会进入细胞，导致细胞继续膨胀而破裂。除非细胞膜在破裂前就复原。为避免细胞破裂，往往需要在细胞外的缓冲液加入大分子以维持渗透压平衡。在很多情况下，允许细胞稍微膨胀，会有助于引导药物和分子进入细胞，当水或缓冲液进入细胞时，会把孔道扩大，同时溶解在外液中的成分会随水流被带进细胞。所以一般在穿孔之前，把细胞放人稍低渗透压的缓冲液中，让细胞略微膨胀，细胞膜的张力也因而增高，横向张力可以帮助电压力穿破细胞膜。已有张力的膜很容易扩大，若用于电融合过程，初成的连接孔道也会较容易开扩，因而促成融合。在转染过程中，若需长链的DNA或质粒进入细胞，从理论上讲，需要很长时间，但由于细胞电穿孔后的复原时间仅几十分钟，即使电穿孔足够大，也不可能完成这一过程。但在实验过程中，电穿孔的转染效率比预期高很多。(3) 细胞膜的复原穿孔后细胞膜复原的时间和过程随细胞而异，时间的长短也由复原期间的温度、外液的渗透压、所含离子和药物来决定。细胞膜复原的时间长些，有利于细胞外药物的扩散进入细胞内。对于有些操作过程，需要低温来延缓复原时间。但在复原过程中，细胞膜仍然是有漏洞的，所以内外的胶体渗透压必须仔细调节。在这段时间内，细胞仍然非常脆弱，所以应该避免机械振荡，尽量避免使用移液管或离心操作。细胞外液所含的离子，一方面影响细胞复原期间的细胞生存，另一方面也影响细胞膜复原的速度。以上几个最普通的因素，互相之间也有影响，例如，脉冲的强度和宽度大，孔也越来越多，药物进入快，融合的概率也高，但细胞对胶体渗透压和离子平衡也敏感。因此无论穿孔或融合的效率，在脉冲电压或宽度继续增高的条件下，往往会先达最高效率峰，然后急剧下降，原因就在于细胞死亡。最佳效率的条件是由多种因素匹配决定的，如果了解生物物理的原理，熟悉细胞的特性，就可以设计出适当的仪器和程序，进行电穿孔和电融合。9荧光定量PCR的原理与应用荧光定量 PCR指通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。其应用如下：（1）实时监测产物量，计算初始模板量（2）基础研究的基因表达分析研究（3）临床病原体检测 病人体液中目标基因的检测：病毒,寄生虫,细菌 （4）食品卫生检疫 a.转基因食品的检疫：根据转入基因的特异性区段设计探针 b.食品中病原微生物的检测 10P C R 技术原理及特点：PCR技术又称为聚合酶链式反应，其基本原理是根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理，体外合成目的DNA片段的方法。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。其特点包括：（1）灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平；能从100万个细胞中检出一个靶细胞；病毒检测的灵敏度可达3个RFU；细菌检测的最小检出率为3个细菌（2）简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增（3）对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA11蛋白质分离纯化的依据及其相应的分离纯化方法蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质的肽链数目及每条肽链的氨基酸残基数目，透析、超过滤、分子筛层析、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳等就是依据蛋白质分子大小进行分离纯化蛋白质的； 蛋白质的带电特性蛋白质肽链的氨基末端、羧基末端、酸性氨基酸残基的侧链R基以及碱性氨基酸残基的侧链R基等，在不同的pH条件下会带有不同的电荷，等电点沉淀、离子交换层析、等电聚焦电泳等都是以此为依据来分离纯化蛋白质； 蛋白质的溶解特性大多数蛋白质在水溶液中会形成稳定的胶体溶液，易溶于稀酸、稀碱或稀盐等，当破坏胶体稳定存在的条件时，蛋白质会沉淀析出，硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级分离等均依据此原理； 蛋白质的变性与复性：蛋白质在一定的物理化学条件下会失去原有的空间结构、生物学功能以及部分理化特性等称为变性，在变性条件不剧烈，某些蛋白质在除去变性条件后会恢复原有的空间结构和生物学功能即为复性。例如，采用尿素变性复性的方法从包含体中纯化原核表达蛋白； 蛋白质的结晶：天然蛋白质在一定的物理化学条件下，浓度达到过饱和状态时就会结晶析出，如从鸡蛋中纯化溶菌酶等就可以采取结晶与再结晶的方法； 蛋白质分子表面的特性：蛋白质分子表面疏水氨基酸残基的数目、比例以及分布区域不同，因此它们与吸附剂的吸附作用力不同，蛋白质的吸附层析就是依据此原理； 蛋白质的分子形状：不同的蛋白质具有不同的分子形状，因此其与特定的配基(或配体)具有专一的结合特性，如酶与底物、酶与其抑制剂或激活剂，抗体与抗原，凝集素与葡聚糖等，亲和层析就是以此为依据； 12实验设计大肠杆菌中表达的融合有组氨酸标签的绿色荧光蛋白的分离纯化 (1)选择实验材料：大肠杆菌(含有His-GFP表达质粒)在液体LB培养基中培养，离心，除去LB培养基，收集菌体沉淀。(2)实验材料预处理：用蛋白质提取缓冲液悬浮菌体，离心后收集菌体沉淀，再用蛋白质提取缓冲液洗涤菌体一次，用少量提取缓冲液悬浮菌体，冰浴条件下超声波破碎菌体，离心后的上清液即为绿色荧光蛋白粗提取液。(3)蛋白质粗分级：将绿色荧光蛋白粗提取液装入透析袋中浓缩，透析除去小分子杂质。 (4)蛋白质