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实验八 果蝇的单因子实验09级生物技术02班 杨亚琼 20091052220一：目的1. 理解分离定律的原理；2. 掌握果蝇的杂交技术；3记录交配结果和掌握统计处理的方法。二 原理一对基因在杂合状态中保持相对的独立性，而在配子形成时，又按原样分离到不同的配子中去。理论上配子分离比是1:1，子二代基因型分离比是1:2:1，若显性完全，子二代表型分离比是3:1。这就是分离定律。孟德尔从豌豆中选取了许多稳定的，易于观察的性状观察分析。所谓的性状是生物体所表现的形态特征和生理特性的总称。孟德尔在研究豌豆等植物的性状遗传时，把植株所表现的性状总体区分为各个单位作为研究对象，这些被区分开的每一个具体性状称为单位性状（unit character）.如豌豆的花色，种子形状，子叶颜色，豆荚形状，未成熟豆荚的颜色，花序着生部位和株高等性状。不同个体在单位性状上常有着各种不同的表现，如豌豆有红花和白花，种子形状有圆粒和皱粒，子叶颜色有黄色和绿色等。这种同一单位性状在不同个体间所表现出来的相对差异，称为相对性状。果蝇的长翅（+）和残翅（vg）是一对相对性状。它们是位于常染色体上的一对等位基因。野生型果蝇的双翅是长翅，（+/+）翅长过尾部。残翅果蝇（vg/vg）的双翅几乎没有，只有少量残痕，无飞翔能力。vg的座位是第二染色体67.0。长翅对残翅显性完全。交配方式：用长翅果蝇与残翅果蝇交配，得到子一代都是长翅，子一代雌雄个体间相互交配，子二代产生性状分离，出现两种表型，呈3:1之比。现以长翅雌蝇与残翅雄蝇交配为例 P： 长翅（） 残翅（） +/+ vg/vg F1： 长翅 /vg . 相互交配 F2： 长翅 残翅 (1 +/+,2 /vg) (1 vg/vg) 图1. 果蝇双翅形状的遗传 三材料、仪器与试剂材料：黑腹果蝇 ( Drosophila melanogaster ) 的两个品系： 野生型：长翅果蝇 (+ +) 突变型：残翅果蝇 (vg vg) 野生型果蝇的双翅为长翅 (+ +) ，翅长超过尾部。残翅果蝇 (vg ， g) 的双翅几乎没有，只留少量残痕，无飞翔能力。 仪器设备： 双筒解剖镜，恒温培养箱，天平，培养瓶，麻醉瓶，毛笔、白瓷板,放大镜，棉花，镊子，大烧杯，电炉，玻璃棒，铁架台，漏斗，胶管，无数锥形瓶。 药品试剂 ：乙醚、玉米粉、琼脂、葡萄糖、酵母粉、丙酸。四步骤 1. 培养基的配制：4-5人为一组，按照所需的量配制相应的培养基。现在以300ml为例，培养基的配方如下：A：葡萄糖23.45g,琼脂2.345g，加蒸馏水150ml，煮沸溶解。B:玉米粉30.9375g,加水150ml，加热搅拌均匀后，在加2.625g酵母粉。将A和B混合加热成糊状后，加1.875ml丙酸，即可分装到培养瓶中。每瓶分装30ml左右，将瓶壁擦拭干净后，用纸包扎好后即可进行高压蒸汽灭菌。灭菌后在2到3天内未发生霉变，即可用。培养过程中应注意的问题：1)培养基的防霉。因为酵母菌与霉菌生活环境相似，均为pH4560。所以在培养基的配制、酵母液的制备乃至转管时瓶塞的取放等每一个细节都要按无菌操作的基本要求去完成，防止霉菌的污染。对于已经被霉菌大量污染的培养基应及时倒掉，不宜再用。2)培养的温度。温度对果蝇的生长发育繁殖至关重要。果蝇生活的最适温度为2025。当温度降至0 以下时，生活周期延至57 d以上，生活力明最降低而高于30时引起不育和死亡。因此，选培养箱培养最为妥当。3)保证果蝇种系的纯正。要想保证遗传学实验的杂交测试不受干扰一定要保证亲本果蝇的纯正。如发现有从瓶中逃逸者，必须捕杀。并且经常对亲本果蝇进行性状检查排除杂交者或突变者。4)酵母菌的选择。以往常常使用干酵母片，但其菌体活力较差难以大量繁殖。现在改用发酵面包专用活性酵母粉来制备酵母菌液，效果较好。5)果蝇的复壮。由于长期在低温下生活，果蝇的生活力大大降低。因此，必须挑取个体较大，繁殖力较强的雌雄果蝇，装入新培养瓶，继续培养。 2 、交配方式：用纯系残翅果蝇 ( 雌 ) 与长翅果蝇 ( 雄 ) 交配，此为正交实验；反交实验以长翅果蜗为母本、残翅果蝇为父本，由此得 F1 代。 F2 代雌雄个体相互交配， F2 代出现性状分离，如下图 P 残翅 ( ) 长翅 ( ) / vg/vg F1 长翅（、 ） /vg F2 长翅、惨翅 3 、选野生型和残翅果蝇为亲本。雌蝇一定要选处女蜗，可在实验前 2-3 天陆续收集，雌雄个体分开培养数目多少根据需要而定。将雌雄果蝇放在一起培养，雌蝇的生殖器中有贮精囊，可保留交配所得的大量精子，雌蝇一次交配所得的精子，足够它多次排出的卵受精，因此在做杂交试验时，雌蝇必须选用处女蝇（没有交配过的雌蝇）。那么如何才能得到处女蝇呢？一般来说，刚羽化出来的果蝇在 12 小时之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的 8 小时内挑选。因此，在杂交实验开始的一段时间内，各实验小组要根据自己的实验设计，精心挑选处女蝇。为了操作方便，可以在每天晚上 22 ： 00 23 ： 00 将培养瓶内的成蝇杀死，次日早晨 8 ： 00 9 ： 00 对新羽化出的果蝇进行挑选。4、成体果蝇好动，如何将它们成功移入新培养瓶呢?有效的方法是麻醉。所用的麻醉瓶可直接用干净的培养瓶，或用广口瓶代替。用左手小指与无名指夹取麻醉瓶瓶塞。在瓶塞滴加数滴乙醚。取果蝇培养瓶轻拍瓶壁，使果蝇震落在瓶底。再用左手无名指与中指夹取培瓶塞培养瓶口与麻醉瓶口对接轻拍上方的培养瓶将果蝇落到麻醉瓶里。然后迅速盖好两个瓶塞，半分钟左右，果蝇被麻醉，活动缓慢，注意麻醉不得过度，如果果蝇两翅展开且肢体僵硬说明已致死。因此，必须抓紧时间移人新培养瓶中可将培养瓶横卧，用干净毛笔把果蝇挑人，待果蝇清醒后再竖立加塞，防止果蝇粘在培养基上。首先把残翅处女蝇倒出麻醉，挑 5 只移到水平放置的杂交瓶中，再把长翅倒出麻醉，挑选 5 只雄蝇，移到上述杂文瓶中。等杂交亲本在杂交瓶中全部苏醒后，将杂交瓶直立，并移入 25 温箱中培养。同时，按上述操作进行反交实验接种培养。注意按下述方式贴好标签：5、7 天后，释放杂交亲本。6、再过 4-5 天， Fl 成蝇开始出现，观察 F1 翅膀 ( 表型 ) ，注意显、隐性关系，连续检查 2-3 天，并计数统计，或在释放亲本 7 天后集中观察。 7 、选取正、反交各 5 对 F1 雌雄果蝇，分别移入一新培养瓶 ( 这里不需用选取处女蝇 ) ，置 25 温箱小培养。当看到培养瓶内有蛹出现时，及时将亲本处死，以防发生回交。 8 、 7 天后，释放 Fl 亲本。再过 4-5 天， F 2 代成蝇出现后，进行观察统计，可连续统计 7-8 天，观测数目在 200 只以上。被统计过的果蝇倒入水槽冲掉。 注意事项： 1.杂交前必须选择处女蝇 2.挑果蝇时，除了要注意雌雄外，还要注意性状，防止因果蝇混杂而引起实验结果的失败。 3.不可麻醉过度。 4.放到培养瓶中时要先把瓶子倾斜，待果蝇苏醒后再把瓶子竖起来，防止果蝇粘在培养基中而不能苏醒。 5.剩余的果蝇可放到大瓶子中，以保留种用。 6.写好标签放到培养箱中。7.无论是对 F 1 还是对 F 2 进行统计，都要及时进行，避免陆续羽化出的果蝇在培养瓶内交尾后将卵产在培养基内。因此要求实验者不断进行观察，只要有新羽化出的果蝇，就要及时取出，并进行统计和观察。5 过程记录及结果统计表1.果蝇单因子杂交实验过程记录观察日期实验室温度（ ）大气压（KPa）恒温箱的温度（ ）过程记录10.2218.582.1323.2收集本实验所需的长翅和残翅处女蝇10.2317.281.8523.8收集处女蝇10.2416.882.1322.5收集处女蝇10.2615.783.1923.1残翅处女蝇开始出现，连续收集三天10.2915.383.9822.8进行杂交（正反交各一瓶）11.516.582.8321.8有大量幼虫出现，回收亲本11.917.381.3222.0有F1成蝇出现，记录所观察的现象，并同时进行杂交（6:6）11.1016.181.8522.3观察并统计了F1成蝇的性状11.1218.582.1723.5观察并统计了F1成蝇的性状11.1615.883.7522.3去除F1代亲本，继续培养11.2116.983.1521.5有F2代成蝇出现，观察并统计了所观察到的结果11.2314.882.9522.2观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状11.2416.283.1222.0观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状112616.182.8522.3观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状112815.983.5221.4观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状12.115.382.9321.9观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状12.514.883.5821.8观察并统计了F2代成蝇所观察到的性状F1代：表2.F1代结果统计表 观察结果统计日期正交：/vg/vg 反交：vg/vg+/+ 实验室温度（）大气压（KPa）恒温箱的温度（）长翅数残翅数长翅数残翅数11.9809017.382.3822.511.1019222016.381.8322.811.1228031015.582.2323.1合计552620由表2可以看出：在正交组中F1出现了残翅果蝇（理论上应该全是长翅果蝇），继续观察了两天后并未发现有残翅果蝇出现，造成这种现象的原因可能有以下几点：（1）.在做杂交的时候，误把雌蝇当成了雄蝇，导致了结果出现了残翅；（2）.可能是在回收亲本时未将残翅果蝇除干净，因为是残翅果蝇，且在培养瓶中放有滤纸片，残翅的果蝇隐藏于其中而未被发现，直到后面统计时才发现，导致了这种现象的产生。在反交组中并未出现这样的状况。由此表还可以看出，正反交的群体数量在不断增大，但并不是很明显，着可能和实验室温度有很大关系。表3. F2代结果统计表 观察结果统计日期正交：/vg/vg 反交：vg/vg+/+ 实验室温度（）大气压（KPa）恒温箱的温度（）长翅数残翅数长翅数残翅数11.21728316.883.1521.511.239721715.982.9522.211.2414518614.883.1222.011.2627825916.282.8522.311.28269311216.183.5221.411.2912518515 883.2322.41213513311015.382.9321.912.53210311114.383.5821.8合计1725918363由表3可以看出：正反交均统计了14天，但由于实验室条件的限制，我们并没有连续观察。通过表可以明显的观察到正交和反交的长翅数明显多于残翅数，且正交和反交的长翅数和残翅数相差不大，通过此表可初步判断该实验合理的。表4. 不同 2值和不同自由度（n）时的P值x2 pn0.990.950.900.800.700.500.300.200.100.050.020.0110.000160.040.0160.0640.1480.4551.0741.6422.7063.8415.4126.63520.02010.1030.2110.4460.7131.3862.4083.2194.6055.9917.8249.2103o.1150.3520.5841.0051.4242.3663.6654.6426.2517.8159.83711.34540.2970.7110.0641.6492.1953.3574.8785.9897.7799.48811.66813.27750.5541.1451.6102.3433.0004.3516.0647.2699.23611.07013.38815.086 2测验（正交）表5. 对正交结果进行 2测验 2测验长翅（+）残翅（vg）合计实验观察数（O）17259231预期数（3:1）（e）173.2557.75231偏差（o-e）-1.251.25231(o-e)2/e0.0090190.027056231 20.036075根据卡平方公式可求得 2=0.036075，查表4可知，当n=1时可查得0.80P0.90.表面理论值与实际值之间的偏差属于随机误差，也就是说，可以认为观察值是符合假设的。说明该实验的正交是成功的，是可信的。 2测验（反交）表6. 对反交结果进行 2测验 2测验长翅（+）残翅（vg）合计实验观察数（O）18363246预期数（3:1）（e）184.561.5246偏差（o-e）-1.51.5246(o-e) 2/e0.0121950.036585246 20.04878246根据卡平方公式可求得X2=0.04878，查表4可知，当自由度为1时，0.3P0.5,表明理论值与实际值之间的偏差属于随机误差，也可以说，可以认为观察值是符合的。说明本实验的反交也是成功的，可信的。 2测验表7. 对正反交合并结果进行统计X2测验长翅（+）（正反交合并）残翅（vg）（正反交合并）合计实验观察数（O）355122477预期数（3:1）（e）357.75357.75477偏差（o-e）-2.752.75477(o-e)2/e0.0121950.036585477 20.084556将正反交合并后进行卡平方测验可求得X2=0.084556，查表4可知，当自由度为1时，0.3P0.5,表明观察值与理论值之间的偏差属于随机误差，因此可以认为观察值是符合的。即正反交结果合并后仍符合孟德尔的分离定律，即长翅数与残翅数的比列接近3：1，由此结果可知，正交所得地的长翅数和残翅数与反交所得的长翅数与残翅数相差不大，说明本实验是成功的，是可信的。六：结果分析对以上所得的结果进行分析如下： 由正交结果进行 2测验结果可知0.8P0.9，长翅数与残翅数的比值接近3：1,由反交结果进行 2测验结果可知0.8P0.9，长翅数与残翅数的比值也接近3：1，由此可以确定果蝇的长翅与残翅这一相对性状是位于常染色体上的一对等位基因，这对基因在杂合状态中保持相对的独立性，而在配子形成时，又按原样分离到不同的配子中去，导致子二代的表性比为3：1.同时也可以确定长翅是受显性基因控制的，而残翅则是受隐性基因控制的。 将正反交合并后进行 2测验可知0.7P0.8，同样符合孟德尔的分离比例，只是合并后的概率比没有合并后的要小，说明正交与反交之间存在一定的差异，但明显看出这个差异不是很大，存在差异的原因是由许多因素造成的，如温度，大气压，人为因素等等。我认为最主要的因素则应该是果蝇本身。正交是用长翅作为母本，反交则是用残翅作为母本，因为残翅果蝇无飞翔能力，进行杂交时较用残翅做父本时更加容易，因而造成了正反交之间的差异。七：结论 根据以上实验结果并对其进行分析后可得到如下结论： 1.果蝇的长翅与残翅是位于常染色体上的一对等位基因，并且长翅是受显性基因控制的，为显性，而残翅则是受隐性基因控制的，为隐性。 2.常染色体上的遗传其正交和反交的结果是一致的，并不受到性别的决定。 3.用长翅果蝇与残翅果蝇进行交配，配子分离比为1：1，子一代雌雄个体间相互交配，子二代基因型分离比为1：2：1，显性完全时，子二代表型分离比是3：1. 4.用果蝇的长翅与残翅进行杂交，F2代长翅数与残翅数之比为3：1，符合孟德尔的分离定律。八： 讨论 1.就本次试验而言，可采用什么样的方法来验证分离定律？ 分离定律的实质是指位于一对同源染色体上的一对等位基因在配子形成过程中，彼此分离，互不干扰，各自独立的分配到不同的配子中去，每个配子中只含有一对基因中的一个成员，对本次实验的真实性可以采用不同的方法进行验证。（1）.测交法（test cross）:测交法是把被检测的个体与隐性纯合体杂交，由于测交时常利用一个原来的隐性纯和亲本进行杂交，故又常称为回交，根据测交子代所出现的表型种类和比例，可以确定被测验个体的基因型。由于隐性纯合体只能产生一种含隐性基因的配子，他们与含有任何基因的另一种配子结合，其子代将只能表现出另一种配子所含基因的表型，因此，测交子代表型的种类和比例正好反映了被测个体所产生的配子种类和比例。在本次试验中，我们已经验证了长翅与残翅是位于常染色体上的一对等位基因，要验证F2的表型分离比为3：1，即验证分离定律，可以用纯和的长翅果蝇和残翅果蝇进行杂交，F1代表现性为长翅，当用F1再与残翅果蝇测交时，F1形成两种配子，它们的数目应相等。而测交亲本的基因型只产生一种配子，因此在测交子代中，应该有1/2的果蝇基因型是显性，表现为长翅，1/2的表现为残翅。 长翅残翅 长翅残翅 + vgvg +vg vgvg 配子： + vg + vg vg F1: +vg +vg vgvg （长翅） (长翅) （残翅） 1 ： 1 图1：果蝇翅型的理论结果（2）.自交法按照孟德尔的假设，在F2代中凡表现隐性性状的类型其自交后代不会发生性状的分离，而表现显性性状的类型中应有1/3的个体自交后不会发生性状分离，2/3个体自交后代中仍会发生性状分离，且显性与隐性之比为3：1.在本次实验中，用F1代进行“自交”，其结果证实了这一推论，但是我们仅仅做到了F2代，显然并不能下定结论，孟德尔用豌豆的7对性状研究时，直到F7代仍符合，我们应该多做几代，若所有的结果仍符合这一推论，才能验证分离定律。2.分离比例实现的条件？（1）.研究的生物体必须是二倍体（体内染色体成对存在），并且所研究的相对性状差异明显。 （2）.在减数分裂过程中，形成的各种配子数目相等，或接近相等，不同类型的配子具有同等的生活力，受精时各种雌雄配子均能以均等的机会相互自由组合。 （3）.受精后不同基因型的合子及自由合子发育的个体具有同样或大致同样的存活率。 （4）.杂种后代都处于相对一致的条件下，而且试验分析的群体比较大。3.群体规模的大小对分离定律的影响？ 在本次实验中，群体规模的大小直接影响到实验的成败，群体规模必须要足够大，这样将不会产生很大的误差，如果我们研究的群体规模不是足够大的话，即使得到的结果也符合理论值，但是这并不能够代表实验的成功，因为会存在许多的偶然行，也会有很大的误差。因此，在做果蝇的实验中，必须要有足够大的群体规模，这样才具有说服力。因此，群体规模的大小是实验成功的关键所在。4.孟德尔的分离定律是否是完善的，有没有什么不足之处？是否满足分离定律条件的所有生物都是按照孟德尔方式遗传的？分离定律的实质是指位于一对同源染色体的上的等位基因在配子形成过程中，彼此分离，互不干扰，各自独立的分配到不同的配子中去，每个配子中只含有一对基因中的一个成员，理论上配子分离比是1：1，子二代基因型分离比是1：2：1，若显性完全，子二代表型分离比是3：1.到目前为止，分离定律仍被广泛接受，其不足的地方尚未发现，它具有很重要的理论意义：（1）.形成了颗粒遗传的正确观念;(2).指出了区分基因型的与表现性的重要性；（3）.解释了生物变异产生的部分原因；（4）.建立了遗传研究的基本方法。分离定律对生物遗传改良工作有重要的指导意义。孟德尔是用豌豆的7对性状进行研究，从而发现了分离定律。由于生物界物种多样，满足分离定律条件的生物数不胜数，小到微生物，大到哺乳动物等，目前还未对其一一进行研究，因为微生物个体较小，繁殖快，不易于观察，要用其来研究尚存在一定的困难，实验室常用的果蝇，是符合孟德尔式遗传的。九作业1.果蝇主要有哪些突变体？答： 果蝇常见的突变体主要有：残翅, 白眼, 黑檀体, 焦刚毛,小翅等。 实验中使用的果蝇突变品系：影响部分突变名称基因符号染色体上座位翅残翅VgR67.0眼色白眼wX1.5体色黑檀体eR70.7刚毛焦刚毛sn3X21.0翅形小翅mX36.1果蝇常见的突变表型： 突变型基因符号表现特征基因所在染色体白眼棒眼褐色眼猩红眼黑檀体黄体焦毛黑体匙形翅残翅翻翅短翅wBbwstcysnbnub2vgCym复眼白色复眼呈狭窄垂直棒形，小眼数少复眼褐色复眼猩红色身体乌木色，黑亮身体浅橙黄色刚毛卷曲烧曲焦状颜色比黑檀体深翅小匙状翅退化，不能飞翅向上翻卷，纯合致死翅膀短小，不超过身体XXIIIIIIIIXXIIIIIIIIX2.为什么做果蝇品系间杂交时，母本必须选用处女蝇？如何收集处女蝇？杂交F1代的安全期是如何确定的？答：因为雌果蝇生殖器官有受精囊，可保存交配所得的大量的精子，能使大量的卵细胞受精。因此，在做果蝇杂交实验的时候，雌果蝇必须是处女蝇，保证实验结果的可靠性。 一般来说，刚羽化出来的果蝇在 12 小时之内是不进行交配的，所以在这段时间内选出的雌蝇即为处女蝇。为了保险起见，可以在羽化后的 8 小时内挑选。因此，在杂交实验开始的一段时间内，各实验小组要根据自己的实验设计，精心挑选处女蝇。为了操作方便，可以在每天晚上 22 ： 00 23 ： 00 将培养瓶内的成蝇杀死，次日早晨 8 ： 00 9 ： 00 对新羽化出的果蝇进行挑选。雌果蝇自羽化开始10小时之内尚未成熟而无交配能力。选择处女蝇时，先把培养瓶中的老果蝇全部除去，收集10小时之内羽化出来的新果蝇，麻醉后用放大镜在百瓷板上将果蝇雌雄分开，这时得到的雌果蝇应该全部都是处女蝇。如果要验证选取的处女蝇是否准确，先不要放入雄蝇，3天后看雌蝇是否产卵，如果产卵就不是处女蝇了。当证明确实是处女蝇的情况下再放入雄蝇，进行遗传杂交实验。杂交F1代的计数安全期是自培养开始的20天内。因为再晚些，就可能会出现F2代了。 杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。杂交的F1代的计数安全期是自培养开始的20天内（因为再晚些时，F2也可能有了）。 3.对之前的果蝇刚毛，眼睛，翅膀实验总结一下，进行对比且说明翅膀本身的演化与功能？答：果蝇的刚毛主要是用来研究数量性状遗传。而由于果蝇的红眼和白眼是位于X染色体上，因此用果蝇的眼睛来研究伴性遗传。果蝇的长翅和残翅这一相对性状则是位于常染色体上的，且较容易观察，因此用它来研究单因子遗传。果蝇的刚毛只能用数的方法加以度量，呈现出连续的变异，表现为数量性状的特点，因此常用果蝇的刚毛来研究数量性状遗传的特性。而果蝇的红眼和白眼，长翅与残翅都是彼此差别明显，一般没有中间过渡类型，这种呈现不连续变异的性状叫质量性状。数量性状的遗传要比质量性状复杂得多，它是由多对基因控制的，而且它们的表现易受环境条件变化的影响，同一品种在不同环境条件下，数量性状的表现会有很大差别，因此，在研究数量性状的遗传时，往往要分析多对基因的遗传表现，并要特别注意环境条件的影响。现对果蝇的数量性状遗传，伴性遗传，单因子实验进行总结及对比如下：数量性状的观察研究结果是一系列的数字材料，只有对这些数据进行适当的统计分析，估算一些遗传参数如遗传率以反映其遗传变异的特点，才能洞察其中的规律，由于大多数基因表现为群体性而缺乏个体性，因此分析时只考虑群体平均值，不强调个体的作用。果蝇的伴性遗传是用位于性染色体（X染