怀山药多糖成分提取.doc

课 程 设 计 说 明 书课程名称： 新编生物工艺学设计题目：怀山药多糖成分提取院 系：生物与食品工程学院学生姓名： 学 号：200706030016专业班级：07生物工程指导教师： 关 现 军 年 月 日课 程 设 计 任 务 书设计题目怀山药多糖成分提取学生姓名易萌所在院系生物院专业、年级、班07生物工程一班设计要求：学生应完成的工作：研究水浸提法提取怀山药多糖、用三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件。通过四次试验、获得如下最佳工艺条件：温度100、加水量1:30、加入10%的3%三氯乙酸溶液除蛋白效果最好、加入浓缩5倍体积的无水乙醇是较好的纯化工艺。参考文献阅读：【1】范俊安，周斌山药水溶性多糖提取工艺的初步研究J重庆中草药研究，1999，39：20222】毛丽珍，撩世芳，等天赐胶囊中多糖的含量测定J】中草药，200l，32(3)：2152163 苗明三怀山药多糖对小鼠免疫功能的增强作用J】中药药理与临床，1997，13(3)：25264】苗明三怀山药多糖抗氧化作用研究【J】中国医药学报，1997，12(2)：22235】陈金秀，高松颖，等怀庆山药对小鼠脑内单胺递质水平的影响【J】.中国中药杂志，1998,23（11）：693694.工作计划：用开始两周的时间进行课程设计的实验，包括实验设计、实验准备、实验实施、实验结果的记录、实验的后续补充。实验全部完成后，进行课程设计的撰写，讨论实验结果，提出问题、解决问题、得出结论与探索的新方向，完成本次课程设计。任务下达日期： 年 月 日 任务完成日期： 年 月 日指导教师（签名）： 学生（签名）： 怀山药多糖成分提取摘 要：研究了水浸提法提取怀山药多糖、三氯乙酸法除蛋白及乙醇分离多糖的纯化条件。水浸提正交实验结果表明，温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次为最佳工艺条件；真空浓缩提取液至三分之一，加入10的3三氯乙酸溶液除蛋白效果最好；再加入浓缩液5倍体积的无水乙醇是较好的纯化工艺。最后讨论杂蛋白去除各种方法的比较。关键词：怀山药，多糖，水浸提法，三氯乙酸目 录1.设计背景11.1怀山药简介21.2怀山药多糖成分提取的意义32.设计方案页码2.1原材料制备 页码2.2多糖成分的粗提取 页码2.3获得最佳温度最佳加水比 页码2.4三氯乙酸法除蛋白.页码2.5多糖分离无水乙醇 页码2.6总工艺流程列叙 页码3.方案实施页码3.1原材料制备具体实施 页码3.2多糖成分的粗提取具体实施 页码3.3获得最佳温度最佳加水比具体实施 页码3.4三氯乙酸法除蛋白具体实施页码3.5多糖分离无水乙醇具体实施 页码4.结果与结论页码4.1水浸提实验最佳工艺条件页码4.2多糖纯化后的含量页码5.收获与致谢页码6.参考文献页码7.附件页码.1. 设计背景1.1怀山药简介山药又名薯蓣，原名薯豫。属薯蓣科，为多年生植物。山药形似萝卜，用筷去皮后，肉呈白色，煮熟后糯软味美。它的块根除去外皮后，可入药。山药加工后呈园柱形，表面黄白色，光滑，质坚硬，断面白色、粉质，气微甘味酸，嚼之发粘。山药原产中国，南北各省均有栽培，尤以怀庆府所产山药名贵。怀山药又称白山药、怀参，为全国之冠。神农本草云：山药各地均产，以河南怀庆各地产者良。 山药中含有皂碱、粘液质、尿囊素、胆硷、精氨酸、淀粉酶、蛋白质、维生素C、B、4一二羟基苯乙胺等，粘液中含甘露聚糖与植酸。其性味甘、平、入肺、脾、肾经，具有健脾止泄、补肺益肾之功用。主治脾虚、久泻、慢性肠炎、肺虚咳喘、慢性肾炎、糖尿病、遗精带下、小便频数等症。怀山药为滋补佳品，素有怀参之称。据本草纲目记载山药补虚羸，除寒热邪气，补中，益气力，长肌肉，强阴，久服耳目聪明，轻身延年。怀山药中含有大量的蛋白质、各种维生素和有益的微量元素、粘质多糖等, 还含有尿囊素、山药素、皂苷、胆碱、盐酸多巴胺等药用成分, 是营养价值很高的药食同源食品, 有健脾、补肺、固肾、益精等功效, 具有强身健体及医疗保健作用。怀山药是我国传统的地道药材之一，历史悠久，其质量为各名医家所称道。怀山药为滋补佳品，素有“怀参”之称。据本草纲目记载“山药”补虚羸，除寒热邪气，补中，益气力，长肌肉，强阴，久服耳目聪明，轻身延年。近年来, 外贸上对山药的需求也日益增大。1.2怀山药多糖成分提取的意义现代医学确认怀山药含有丰富的蛋白质(包括十八种氨基酸)、淀粉酶、糖（甘露糖、半乳糖、葡萄糖）、粘液质、维生素（维生素B2、维生素C）、无机元素及其他微量元素如钙、锰、铜、铬、钼、铁、锶、钒、钡，此外还有胆碱和糖蛋白。粘液质是山药中最重要的药理作用成分，有多糖和蛋白质复合体组成。近期研究表明，怀山药多糖具有重要的生理活性。 怀山药全身都是宝，加工过程中产生的下脚料可制作山药粉、山药饮料、山药酱、怀山药保健果冻、山药软糖等保健食品。然而，目前山药相关饮食品开发还处于起步阶段，相关成分及其含量还未充分阐明，有效成分的提取工艺还很不完善，使山药的价值得不到充分利用。因此，研究怀山药中粘质多糖等药用成分的高效提取工艺，追求其最优提取工艺可以使怀山药得到充分利用，对生产和工艺化研究具有重大意义。2.设计方案 采用热水浸提法提取怀山药多糖，对影响提取多糖工艺参数如浸提温度、浸提时间、料水比等进行单因素实验，并在此基础上设计正交试验，提出提取怀山药多糖最佳工艺条件：温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次。2.1原材料制备将山药洗净，之后去皮，切碎，再进行组织搅碎匀浆，加水在水浴锅里加热，之后冷却，将冷却液固液分离，收集上清液，再次浸提沉淀，收集所有上清液。获得怀山药多糖成分提取的原材料溶液。2.2多糖总量的提取取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。2.3获得最佳温度最佳加水比采用水浸提取法、一浸提可溶性总糖含量作为指标2.4三氯乙酸法除蛋白对3%三氯乙酸溶液的加入量做单因素试验，以蛋白质沉淀和多糖的率为目标2.5多糖分离无水乙醇对无水乙醇加入量做单因素试验，均已多糖沉淀率为指标2.6总工艺流程列叙工艺流程：山药洗净去皮切碎组织搅碎匀浆加水加热冷却固液分离收集上清液再次浸提沉淀收集所有上清液上清液低温浓缩至1/3加入3%三氯乙酸溶液摇匀静置固液分离得蛋白质多糖溶液多糖溶液加入无水乙醇摇匀静置固液分离得多糖沉淀烘干 3. 方案实施3.1原材料制备将山药洗净，之后去皮，切碎，再进行组织搅碎匀浆，加水在水浴锅里加热，之后冷却，将冷却液固液分离，收集上清液，再次浸提沉淀，收集所有上清液。获得怀山药多糖成分提取的原材料溶液。3.2多糖总量的提取取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。苯酚硫酸法测多糖含量简介：苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 原理;多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 试剂;1 浓硫酸：分析纯，95.5% 2 80%苯酚：80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。 3 6%苯酚：临用前以80%苯酚配制。（每次测定均需现配） 4 标准葡聚糖或分析纯葡萄糖。 5 3%三氯乙酸（3%TCA）：3克TCA加97克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。 6 6mol/L 氢氧化钠：120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。 7 6mol/L 盐酸 操作：1制作标准曲线：准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。2样品含量测定： 取样品1克（湿样）加1ml 3%TCA溶液，倒上清液于10毫升离心管中。注意：总的溶液不要超出10毫升。（既不要超出离心管的容量）。 离心，转速3000转/分钟15分钟，取上清液。最后滤液保持18毫升左右。 定容取样。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。 注意：（1）此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久。 （2）制作标准线宜用相应的标准多糖，入用葡萄糖，应以校正系数0.9校正g数。 （3）对杂多糖，分析结果可根据各单糖的组成比及主要组分单糖的标准曲线的校正系数加以校正计算。 （4）测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.10.3之间。比如：小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。3.3获得最佳温度最佳加水比采用水浸提取法、一浸提可溶性总糖含量作为指标。具体采用热水浸提法，在恒温水浴中加热 2 小时，初步获得多糖。具体步骤：1. 取10g怀山药匀浆，按1:30加水，在不同温度(80,90,100)下浸提2小时，除去沉淀，收集上清液，用苯酚硫酸法测定总糖含量。2. 取10g怀山药匀浆，按不同比例加入蒸馏水(1:20,1:30,1:40)，在100下浸提2小时，除去沉淀，用苯酚硫酸法测总糖含量，3. 取10g怀山药匀浆，按1:30加水，采用不同时间(1h,2h,3h)在100下浸提，出去沉淀，用苯酚硫酸法测得总糖含量。4. 绘制图像得到单因素最佳实验条件。5. 做三因素三水平正交分析，试验次数为9次。如下表：6. 测得个次总糖含量，进行正交分析，得到最优搭配。3.4三氯乙酸法除蛋白对3%三氯乙酸溶液的加入量做单因素试验，以蛋白质沉淀和多糖得率为目标。具体步骤：a、将最优条件所得的上清液、分成三份、然后浓缩成三分之一、b、用ph试纸或者ph计测所、 用HCL或NaOH（或氨水）直接调ph到7c、加入的3%三氯乙酸量依次为浓缩体积的5%、10%加入后摇匀、离心、得到蛋白沉淀、d、用烘干机30度烘干 、测得蛋白质的量3.5多糖分离无水乙醇对无水乙醇加入量做单因素试验，均已多糖沉淀率为指标a、这个我们额外做、100度、1:30、浸提两小时、7.5%浓缩体积的3%三氯乙酸、我们做两个、100g*2山药、分成两份 b、两个分别加5倍、3倍体积的乙醇。4. 结果与结论4.1水浸提实验最佳工艺条件综合单个影响怀山药水浸提工艺的因素，从实验的可行性来考虑，最终得到提取怀山药多糖最佳工艺条件：温度100、加水量1：30、时间2h和浸提次数2次。图1.最佳温度最佳加水比下的总糖含量比较图2.最佳浸提次数图3.浸提温度的影响图4.浸提时间的影响4.2怀山药多糖纯化后多糖含量三氯乙酸无水乙醇多糖量5%1：4 100:0.97.5%1：3100：1.051: 4100：1.171: 5100：1.31图一.怀山药多糖纯化后多糖含量比较图二.无水乙醇加入量的影响注：随着无水乙醇量的增多，多糖得率提高，但增加到1:5（V/V）之后，多糖得率的增加幅度不大，故无水乙醇加入量确定为多糖溶液：无水乙醇为1:5（V/V）。4.3杂蛋白去除方法的比较将蛋白酶解法、三氯乙酸沉淀法、NaoH法和Sevag法分别做验证实验。脱蛋白过程中使蛋白质沉淀的机理可能是造成多糖损失的主要原因, 三氯乙酸沉淀法脱蛋白效果最好且多糖得率最高。三氯乙酸沉淀法：多糖溶液中逐渐加入3%TCA并不断搅拌，同时观察溶液中是否有沉淀生成；若有，则过滤沉淀。实际过程：采用了40ml 3%的鞣酸（浅黄色），样品由原来的深褐色变成较深的棕红色，容器底部有沉淀生成。Sevage法：将等体积的多糖溶液加入分液漏斗，加入Sevage试剂（Sevage/样品约大于1/2）,摇均后静置分层，除去白色泡沫层和下层有机相，重复35次，保留上层液体，有机相从下方倒出，回收。NaoH法：向样品中滴加1mol/L的NaoH溶液，使溶液的PH在碱性范围内，去除沉淀后，调整PH至中性（1mol/L盐酸），记录处理后的体积。酶法：原料酶解液离心后所得上清液中加入氯仿正丁醇混合溶液进行充分振荡，将游离蛋白变性成为不容物质，经离心分离去除，测定水相中蛋白残余量。5. 收获与致谢经过两周的实验和之前的选题与最后的课程设计撰写，本课题最终形成了定稿。在这样的过程中，我得到了很多人的帮助，特在此感谢。在选题及进行过程中得到关现军老师的悉心指导。论文行文过程中，关老师又多次帮助我分析思路，开拓视角，在我遇到困难的时候给予我最大的支持和鼓励。关老师严谨求实的治学态度，踏实坚韧的工作精神，使我终生受益。在此，谨向老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。 感谢我院实验室所有老师对我进行实验时的帮助和关怀，正是您们的辛勤工作，认真指导才使我得以顺利地完成实验，完成对本课题的探索。在此期间，我不仅学到了许多新的知识，而且也开阔了视野，提高了自己的设计能力。其次，我要感谢我们组的全体成员，没有大家的相互配合、相互帮助，也就没有我们最后的成功。我们共同思考解决了不少难题，为我以后在求学生活的道路上打好了坚