乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器 转基因动物技术 加快家畜品种的改良速度 提高肉 奶 蛋的产量和品质 生产珍贵的药用蛋白 为大量患者造福 转基因动物最诱人的前景是作为生物反应器 利用它生产人类所需要的生物活性产品或药物 其常用方法是把目的基因在血液循环系统 唾液腺或乳腺等器官或组织中表达 从而获得人类需要的目的产物 根据目的蛋白表达部位的不同可分为乳腺生物反应器 血液生物反应器 卵生物反应器 尿生物反应器 精囊腺生物反应器 唾液腺生物反应器等 乳腺生物反应器的原理及步骤 乳腺生物反应器的研究进展 乳腺生物反应器的存在的问题 乳腺生物反应器的优点及其应用 原理 应用重组DNA技术和转基因技术 将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中 经胚胎移植得到转基因乳腺表达多肽药物 工业酶 疫苗和抗体等蛋白的技术 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区 即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列 这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下 使其在乳腺中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白 乳腺生物反应器的原理及步骤 步骤 转基因动物生产红细胞生成素 EPO 将EPODNA分别以Hind 和BamHI酶切 回收5 4kb的Hind BamHI片段 插入pGEM 7zf 载体 再将867bp的BLG启动子插入EPO基因之前EcoR ClaI位点 构建表达载体pGEM 3zf LG EPO 通过显微注射方法得到转基因小鼠 其乳腺中的EPO含量可达0 5 g ml 20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想1987年 Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织纤溶酶原激活剂 tPA 基因 1991年 WrightG等培育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因绵羊 表达水平高达35g L 在世界范围内引起了极大的轰动 1991年 Brem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔 表达水平达到1 10g L 1992年 Ve lande 等报道了乳腺表达人C蛋白的转基因猪 表达水平达到1g L以上 目前 从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶 抗凝血酶 和人C蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段 并已初步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业 乳腺生物反应器的研究进展 国外研究进展 20世纪80年代初 施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构想 并成功获得表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔 为我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础 1995年 我国首次在小鼠乳腺中成功地表达了人的基因 1996年10月上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功的能在乳腺中表达人凝血因子 的转基因羊 2005年 国家 863 计划组利用转基因体细胞克隆技术 分别获得了转人乳铁蛋白 转人溶菌酶 转乳清白蛋白等转人基因蛋白 其中人乳铁蛋白和人 乳清白蛋白是国际上首次利用转基因克隆牛而获得的 虽然我国在该项技术上取得了较大进展 但还处于探索阶段 与国外还有一定的差距 自国家 863 计划对 动物乳腺生物反应器应用研究 立项后 逐步受到有关部门和企业界的重视 研究和开发的力度加强 前景非常乐观 国内研究进展 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用DNA重组技术的微生物来生产的药用蛋白 由于细菌等微生物不能进行蛋白质合成后的加工 因而生物活性低 并且具有免疫原性 产品成本低 可以大规模生产药物其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍产品质量高 易提纯生物活性与天然蛋白几乎完全一样 极易提纯 乳腺生物反应器的优点及其应用 应用 组织纤溶酶原激活剂 TPA 由美国遗传技术公司开发的血栓溶解剂 1987年11月经联邦食品及药物管理局 FDA 批准上市 1988年的销售额为1 5 1 6亿美元 1989年为1 8 1 9亿美元 今后每年的市场销售额约为2 2 5亿美元 重组人抗凝血酶ii 世界上第一个动物乳腺生物反映器重组蛋白药物 重组人抗凝血酶iii具有抑制血液中凝血酶活性 预防和治疗急慢性血栓血塞形成 对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果 2010年 转基因动物生产的重组蛋白产品销售额达到350亿美元 生产的药物将占整个基因工程药物种类的90 以上 目的基因在动物基因中的整合问题 由于目的基因在动物基因中的整合是随机的 因此包括整合位点 整合的拷贝数等机制还不清楚 所以易发生调节失控 遗传不稳定 表达率不高等问题 乳腺生物反应器的存在的问题 转基因动物的成活率低 在目的基因的分离和改造 乳腺特异表达载体的构建及转基因技术的关键性技术上存在缺陷 无法保证对基因的定点整合 因此转基因动物常会出现繁殖力下降 胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷 安全性 动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰 但由于牛 羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应 如出现蛋白质水解等问题 此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大的威胁 所以在分离过程中要去除所有可能引起人类变态反应的蛋白质 同时对含量低的产物加以