PGS操作规范化流程.docx

MDA 法全基因组扩增 (注:为避免DNA污染,需在超净工作台中操作,操作前紫外杀菌30min使用无菌 耗材,且使用带滤芯的吸头)1、准备Buffer DLB:将Buffer DLB管离心使干粉聚集到管底,加 500l无核酸酶水,Vortex彻底混匀使其溶解,短暂离心(溶解后BufferDLB可在-20C保存6个月)2、准备Buffer D2:(下表为配制12个反应,-20C可保存3个月)ComponentVolume1M DTT3 lBuffer DLB33lTotal36 l3、将细胞样本离心,使其离心至管底,用PBS补至4l4、加3l Buffer D2,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心(注:加反应液时枪头不要碰到细胞样本以免带走细胞细胞样本液一般为1-2l)5、PCR仪上65C孵育10min,【程序设MDA1】加热盖(热盖温度可设为90C)取出时放冰上.6、反应完成后立马加3l Stop Solution,手指轻轻拨动PCR管混匀,瞬时离心,放冰上7、冰上融化REPLI-g sc DNA Polymerase(最后加入),其余组分室温融化后vortex混匀,瞬时离心后放置冰上按照下表配制反应:ComponentVolumeH20 sc9lREPLI-g sc Reaction Buffer29 lREPLI-g sc DNA Polymerase2 lTotal40l (注:Reaction Buffer解冻后可能会有沉淀,Vortex约10s使其彻底溶解后用)8、 上述反应液混匀后取40l加入步骤6的10l DNA中,混匀,瞬时离心9、 PCR仪上30C孵育8h(热盖温度为70C)10、 PCR仪上65C孵育3min使酶失活【程序设MDA2】11、扩增产物4C短期保存,若长期保存则置于-20C。MDA产物纯化( Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System)1、 加50l Membrane Binding Solution 于 50l MDA 产物中, vortex后轻甩室温放1min,12000rpm 1 min2、 加700l Membrane Wash Solution,12000rpm 1min，弃液倒扣，注意不要交叉污染样本。3、 加500l Wash Solution,12000rpm 1min4、 12000rpm空转2min弃净多余液体,室温晾干3min5、 加50l无核酸酶水至离心柱膜上,将离心柱换到新的EP管上，室温放置5min后12000rpm离心1min,收集产物 DNA纯化后的产物检测1、浓度:取2l稀释至20l,再取2l用Qubit方法测浓度。2l 样本：198l工作液；标准品10l：190l工作液（工作液1l染料:199lbuffer/样本）标准品1#和2#均需要配置。静置3min后测浓度。2、 5对引物检测PCR反应体系：名称体积2PCR Master Mix12.5lPrimer Mix8l模板无法定浓度到60-180ng/l每个样本取0.5l水4l模板Total25l5对引物检测PCR反应条件：【 】反应温度反应时间循环数95C5min195C30s4060C30s72C30s72C10min14C-Hold3、电泳:3%琼脂糖凝胶电泳检测,上样量约为10l样本+3l loading buffer120V 15min。(5条带为标准，3条带亦可上机测序)。文库构建(用life Tech 的Ion Xpress Library Kit )一、DNA片段化:1、 DNA起始量为120ng,取适量体积DNA于PCR管中,补水至35l2、 Ion Shear plus 10X Reaction Buffer 和 Enzyme Mix II Vortex 混匀各 5s,瞬时离心后放置冰上3、 加5l 10X Reaction Buffer于PCR管中,吹吸10次左右混匀4、 加入10l EnzymeMix II,吹吸混匀,手指轻轻拨动混匀5、 PCR 仪上,37C孵育 35min【】(注意:严格控制反应时间)6、 孵育后立即加入5ul Stop Buffer,vortex彻底混匀,瞬时离心后置于冰上二、纯化1、取出XP磁珠充分混匀并平衡到室温，取1.5ml EP管加99l XP磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育5 min，离心2s。2、磁吸34min,弃上清。3、加500l新鲜配制70%乙醇,磁力架上旋转2周约30s,弃上清4、重复步骤3室温晾干（观察，若转动EP管磁珠不再移动即已晾干）。5、加25l low TE，Vortex 5s，静置30s,瞬离，磁吸3min，吸25l上清至0.2ml PCR管中。三、连接头注意：一次只能打开一管barcode，避免交叉污染，体系中酶最后加含barcode文库的反应体系ComponentVolumeDNA 25l10X Ligase Buffer10lIon P1 Adapter2 lIon Xpress Barcode X2ldNTP Mix2 lNudease-free Water49lDNA Ligase2lNick Repair Polymerase8lTotal100l配好体系后吹吸混匀,放入PCR仪,反应程序如下: 【 】25C15min72C5min4CHold四、纯化1、取出XP磁珠充分混匀并平衡到室温，取新的1.5ml EP管加180l XP磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育5 min，离心2s。2、磁吸34min,弃上清。3、加500l新鲜配制70%乙醇,磁力架上旋转2周约30s,弃上清4、重复步骤3室温晾干（观察，若转动EP管磁珠不再移动即已晾干）。5、加20l low TE，Vortex 5s，静置30s,瞬离，磁吸3min，吸25l上清至0.2ml PCR管中。(注:此步骤完成后若不立即进行后续实验可放入-20C短期保存)五、片段选择(使用E-GelSizeSelect 2% Agarose Gel) 1、准备好E-GelSizeSelect 2% Agarose Gel和iBase unit 连接好电源,取出胶上的梳子后放好位置，选择“SizeSelectTM2%”程序，调整时间为 16min2、样本上样20ul，Marker上样10ul，按照下表位置点样:（孔1、8不推荐点样，为避免收集的产物浓度不够）胶孔1234Marker5678第一排25l水样品1样品2样品310ul样品4样品5样品625l水20ul20ul第二排25l水25l水25l水25l水10ul 水25l水25l水25l水25l水Marker为50bp Ladder工作液(即用lowTE将50bpLadder原液稀释40倍而成)Marker 片段大小为 50bp100bp150bp200bp250bp300bp350bp (主带) 4003、按“Go”开始电泳在电泳进行至约11min时,再次按“Go”暂停,向第二排2-7孔 (除M)补10ul水后,按“Go”继续4、电泳进行至约13-14min时,Marker的200 bp条带在收集孔中,此时收集液体，再用10l水洗收集孔,两次加一起共约25ul2、 PCR扩增室温解冻PCR Reaction mix和Primermix,轻轻vortex混匀,瞬时离心,使管壁附着液滴离心至管底,放置于冰上制备PCR反应液(冰上),体系如下：ComponentVolumeUnamplified library25 lPlantinum PCR SuperMix High Fidelity100lLibrary Amplification Primer Mix5lTotal130l反应体系加好后,轻微Vertex混匀,瞬时离心,使管壁附着液滴离心至管底放入PCR中反应,程序如下:【 】StepTemperatureTimeCycle195 C5 min1295 C15 s858 C15 s70 C1 min34 CHolding-3、纯化1、取出XP磁珠充分混匀并平衡到室温，取新的1.5ml EP管加195l XP 磁珠/管，将样本加入其中，Vortex 5s，室温孵育5 min，离心2s。2、磁吸34min,弃上清。3、加500l新鲜配制70%乙醇,磁力架上旋转2周约30s,弃上清4、重复步骤3室温晾干（观察，若转动EP管磁珠不再移动即已晾干）。5、加20l low TE，Vortex 5s，静置30s,瞬离，磁吸3min，吸25l上清至已备好的装有30l XP磁珠的1.5ml EP管中，Vortex 5s，室温孵育5 min，离心2s。6、磁吸34min,弃上清