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第三章细胞培养专用微载体 1 细胞培养 cellculture 细胞 包括单个细胞 在体外条件下的生长 2 组织培养 tissueculture 是指从体内取出组织和细胞 模拟体内生理环境 在无菌 适当温度和一定营养条件下 使之生存和生长并维持其结构和功能的方法 3 器官培养 organculture 指的是应用和组织培养相似的条件 培养的是器官的原基 器官的一部分或整个器官 使之在体外生存 生长和保持一定功能的方法 有关细胞培养的基本概念 4 以上三个层次的培养 又可统称之为体外培养 5 细胞培养技术 就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术 6 动物细胞培养技术 从动物体内取出细胞或者组织 分散成单个细胞 模拟体内的生理环境 在无菌 适温和丰富的营养条件下 让其在体外的培养瓶或培养基上继续生长和增殖的技术 动物细胞培养技术的发展史 萌芽实验 1 1885年 德国人wroux把鸡胚组织放在温热的盐水中维持其存活了10天 2 1887 arnold把白细胞收集在盛有盐水的小碟子里 观察到白细胞的运动 并存活了一段时间 实验缺陷 由于当时的培养基不理想 实验难以重复 不能断定观察到的是真正存活的健康组织或细胞 论证实验 1907年 美国胚胎学家harrison 把蛙胚神经管区的一片组织植入蛙的淋巴血液凝块中 组织不仅存活几个星期 而且从培养的细胞中长出轴突 成功 在于实验方法的设计 防止了细菌的污染 harrison被称为 细胞培养之父 改进实验 1 1910年 burrows在悬滴培养法中用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质 事实证明它比淋巴要好得多 能使神经组织 心脏组织及皮肤生长良好 2 burrows继续与其他同事alexiscarrel合作 成功地培养了成年狗 猫 小鼠 豚鼠等动物的组织 3 burrows和carrel还证明 若把胚胎提取液 鸡胚匀浆的组织 汁 与血浆混合使用 培养物可存活与生长得更好一些 carrel的巨大贡献 细胞的传代 把无菌技术方面的知识引入细胞培养中 发明设计了卡氏培养瓶 carrelflask 在没有抗生素的情况下 使鸡胚心脏细胞维持生存34年 先后传代3400多次 为细胞的传代培养奠定了基础 4 两位美国科学家w h lewis和m r lewis从另一个角度研究了培养技术 他们最先试图用已知成分的合成培养基取代不能正确确定其成分的天然培养基 血浆及胚胎提取液 5 1955年 eagle采用一种成分确定的培养基 dmem培养基 在添加血清的基础上 成功替代了当时普遍采用的生物体液进行细胞培养 细胞培养技术的快速发展阶段 1 20世纪40年代抗生素的发展 无菌技术的成熟 为动物细胞规模化的培养奠定了基础 2 1962年 以capstick等成功进行bhk细胞 幼年仓鼠肾细胞 的悬浮培养为标志 动物细胞进入了规模化生产阶段 发展至今已成为生物 医学研究和应用中广泛采用的技术方法 3 细胞培养始传我国是20世纪30年代 至50年代以后 细胞培养在我国逐步开展起来 动物细胞培养技术的应用 1 疫苗制备 疫苗工业早期 普遍使用人工病毒感染的兔子和牛作为病毒疫苗的来源 培养细胞为病毒的增殖提供了场所 举例 1 vero细胞和狂犬病毒的培养工艺 2 2005年11月 美国国会紧急拨款71亿美元用于预防疾病疫苗的研制 其中28亿用于细胞培养 3 科技日报2006年7月13日讯 美国密西根州动物科学实验室的科研小组日前宣布 他们利用细胞培养技术 开发出制造人类流感疫苗的新方法 2 单克隆抗体制备1975年英国科学家milstein和kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合 成功建立了单克隆抗体技术 而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体 杂交瘤技术 将骨髓瘤细胞与b淋巴细胞融合 建立能分泌均质抗体的杂交瘤细胞系 杂交瘤技术优点 每个b淋巴细胞仅专一地产生 分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体 而肿瘤细胞可以无限增殖 因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体 3 病毒研究举例 sars病毒的发现病料 选择敏感宿主细胞 细胞培养 形态观察研究分析 疫苗制备4 毒性检测实验 1 药物筛选 2 化学物质 放射性物质等的毒性检测 5 疾病诊断 治疗 1 遗传病的产前检查 2 利用培养病毒进行基因缺损治疗 3 器官 组织培养移植举例 皮肤移植 功能细胞培养植入日本用骨髓细胞培养皮肤德研究人员用骨髓干细胞培养出精原细胞不易引发排异反应的 万能细胞 培养成功 4 生产重组蛋白6 其它方面生物科学的基础研究等 vero细胞被成功的用来培养狂犬病疫苗 乙脑疫苗等多种疫苗 在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献 在医药研究种广泛应用 来源 非洲绿猴肾细胞形态 上皮细胞生长特性 贴壁注释 该细胞是日本千叶大学的y yasumura和y kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的 培养液 mem 含2mml 谷氨酰胺和earle sbss 1 5g lnahco3 0 1mm非必需氨基酸 1 0mm丙酮酸钠 10 胎牛血清传代 吸去培养液 用0 25 w v trypsin 0 53mmedta洗一次 以去除血清 血清会抑制胰酶的活性 加2 3毫升trypsin edta 放在37 培养箱内约5分钟 直到细胞全部脱落 加6 8毫升培养液 用移液器把细胞吹散 加适量的细胞到新的培养器皿中 以1 3至1 6为宜 传代期间培养液每周更换2 3次 冻存 95 培养液 5 dmso冻存于液氮 从国际上动物细胞培养技术的发展趋势看 主要有6个方面的发展方向 1 开发细胞培养反应器和培养系统 2 开发培养贴壁细胞的载体 3 开发微囊技术 4 开发杂交 重组技术 5 开发无血清和化学合成的培养基 6 蛋白质浓缩和提纯技术 微载体培养应用此技术于1967年被用于动物细胞大规模培养 经过几十余年的发展 该技术目前已渐日趋完善和成熟 并广泛应用于生产疫苗 基因工程产品等 微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术 其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点 放大容易 目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞 生产疫苗 蛋白质产品 如293细胞 成肌细胞 vero细胞 cho细胞 使用较多的反应器有两种 贝朗公司的biostatb反应器 使用双桨叶无气泡通气搅拌系统 nbs公司的celligen celligenplustm和bioflo3000反应器 使用cell lift双筛网搅拌系统 两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离 第一节采用微载体培养贴壁细胞是当前最有发展前途的一种培养模式 悬浮培养的局限性 1 大部分哺乳动物细胞为贴壁依赖性细胞 需要附壁培养 2 在培养过程中细胞易变异 潜在着致癌危险 培养病毒细胞有时会失去标记 使免疫能力降低 因此悬浮培养的动物细胞或生物制品主要用作诊断试剂 不宜直接用于人体 3 悬浮培养的细胞密度低 微载体培养优点 表面积 体积 s v 大 因此单位体积培养液的细胞产率高 把悬浮培养和贴壁培养融合在一起 兼有两者的优点 可用简单的显微镜观察细胞在微珠表面的生长情况 简化了细胞生长各种环境因素的检测和控制 重现性好 培养基利用率较高 放大容易 细胞收获过程不复杂 劳动强度小 培养系统占地面积和空间小 微载体是指直径在60 250 m 能适用于贴壁细胞生长的微珠 一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成 自vanwezel用deae sephadexa50研制的第一种微载体问世以来 国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上 包括液体微载体 大孔明胶微载体 聚苯乙烯微载体 phema微载体 甲壳质微载体 聚氨酯泡沫微载体 藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等 常用商品化微载体有三种 cytodex1 2 3 cytopore和cytoline 微载体的大小 增大单位体积内表面积 s f 对细胞的生长非常有利 使微载体直径尽可能小 最好控制在100 200 m之间 微载体的密度 一般为1 03 1 05g cm3 随着细胞的贴附及生长 密度可逐渐增大 微载体的表面电荷 据研究 控制细胞贴壁的基本因素是电荷密度而不是电荷性质 若电荷密度太低 细胞贴附不充分 但电荷密度过大 反而会产生 毒性 效应 第二节动物细胞在微载体上贴壁生长机理 原理 其原理是将对细胞无害的颗粒 微载体加入到培养容器的培养液中 作为载体 使细胞在微载体表面附着生长 同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态 贴壁依赖性细胞在微载体表面上的增殖 要经历黏附贴壁 生长和扩展成单层三个阶段 细胞只有贴附在固体基质表面才能增殖 故细胞在微载体表面的贴附是进一步铺展和生长的关键 黏附主要是靠静电引力和范德华力 细胞能否在微载体表面黏附 主要取决于细胞与微载体的接触概率和相融性 贴壁依赖的动物细胞在微载体表面上增殖 可分为贴壁 生长和扩展成单层三个阶段 三个阶段 细胞能否贴在微载体表面上 一 取决于细胞与微载体接触的机率二 取决于细胞与微载体的相融性 这又是与基质表面的化学一物理性质相关 1 搅拌转速 由于动物细胞无细胞壁 对剪切力敏感 因而无法靠提高搅拌转速来增加接触概率 通常的操作方式是 在贴壁期采用低搅拌转速 时搅时停 数小时后 待细胞附着于微载体表面时 维持设定的低转速 进入培养阶段 微载体培养的搅拌非常慢 最大速度75r min 2 细胞与微载体的相融性 是与微载体表面理化性质有关 一般细胞在进入生理ph值时 表面带负电荷 若微载体带正电荷 则利用静电引力可加快细胞贴壁速度 若微载体带负电荷 因静电斥力使细胞难于黏附贴壁 但培养液中溶有或微载体表面吸附着二价阳离子作为媒介时 则带负电荷的细胞也能贴附 细胞在微载体表面贴附的影响因素 最新研究结果表明促使细胞贴壁的蛋白质分子 是冷析球蛋白 coldinsolubleglobulin 或纤粘素 febronectin 两者均属于糖蛋白的一种蛋白质 都是血清中含有的成分 某些动物细胞 如人的成纤维细胞 能合成大量纤粘素 在无血清的情况下 也能贴壁 相反 某些细胞 如许多细胞系或转化细胞 合成这种糖蛋白的量很少 只有在培养基中外加糖蛋白 才能促使细胞迅速贴壁 在这种情况下 可以在培养基中补加血清 来提高糖蛋白含量 所以 无论微载体表面是带正电荷还是带负电荷 表面都可涂一层能吸附细胞的物质 如冷析球蛋白或纤粘素 用来加快细胞贴壁速度 冷析球蛋白和纤粘素 都是微载体和细胞间架桥的蛋白质 二价阳离子所起的作用 是作为细胞与糖蛋白结合的媒介 细胞是通过二价阳离子结合到糖蛋白上 由以上所述 细胞能通过血清中糖蛋白的架合作用 贴在带正负电荷微载体的表面上 如微载体带的是正电荷 还可通过附加的静电吸引力 使贴壁速度加快 因此 若在接种细胞株之前 预先用有血清的培养基培育微载体 能加快细胞的贴壁速度 细胞在微载体表面的生长的影响因素影响细胞在微载体表面生长的因素很多 主要有三个方面 在细胞方面 如细胞群体 状态和类型 在微载体方面 如微载体表面状态 吸附的大分子和离子 微载体表面光滑时细胞扩展快 表面多孔则扩展慢 在培养环境中 如培养基组成 温度 ph 氧以及代谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生长 如果所处条件最优 则细胞生长快 反之生长速度慢 微载体培养操作要点 培养初期 保证培养基与微球体处于稳定的ph与温度水平 接种细胞 对数生长期 而非稳定期 至终体积1 3的培养液中 以增加细胞与微载体接触的机会 不同的微载体所用浓度及接种细胞密度是不同的 常使用2 3g l的微载体含量 更高的微载体浓度需要控制环境或经常换液 贴壁阶段 3 8d 后 缓慢加入培养液至工作体积 并且增加搅拌速度保证完全均质混合 培养维持期 进行细胞计数 胞核计数 葡萄糖测定及细胞形态镜检 随着细胞增殖 微球变得越来越重 需增加搅拌速率 经过3d左右 培养液开始呈酸性 需换液 停止搅拌 让微珠沉淀5min 弃掉适宜体积的培养液 缓慢加入新鲜培养液 37 重新开始搅拌 收获细胞 首先排干培养液 至少用缓冲液漂洗1遍 然后加入相应的酶 快速搅拌 75 125r min 20 30min 然后解离收集细胞及其产品 微载体培养的放大 可以通过增加微载体的含量或培养体积进行放大 使用异倍体或原代细胞培养生产疫苗 干扰素 已被放大至4000l以上 微载体大规模细胞培养的生物反应器系统此技术大规模培养 细胞扩增的效率受到诸多因素的影响和限制 其中主要的限制性因素包括 细胞对剪切力的敏感性 氧的传递以及传代和扩大培养等 而研制的各种类型生物反应器系统则可针对上述限制性因素 为微载体细胞培养与扩增提供低剪切力 高氧传递效率 易于细胞传代等适宜的外部环境 已较多使用的微载体培养系统生物反应器 可以实行计算机控制操作 培养搅拌速度及悬浮均匀程度 温度变化 ph稳定及溶氧供应 o2 n2 co2 空气四种纯化气体按比例调节 罐压 培养体积和通气量等参数全部由电脑自动控制 因此 应用生物反应器系统进行微载体细胞大规模扩增具有明显优势 目前国外相继研制了数种适合进行微载体大规模细胞培养的生物反应器系统 如搅拌式生物反应器系统 旋转式生物反应器系统以及灌注式生物反应器系统等 rotarycellculturesystem rccs cellbridgecelldivision islet 胰岛 liver osteoblast 造骨细胞 wavebioreactor细胞培养生物反应器 从100ml到500l的培养工作体积 1 搅拌式生物反应器系统搅拌式生物反应器系统在微载体细胞大规模扩增研究领域已有较长的研究历史 但因该细胞培养系统容易产生过大的剪切力 从而限制了其应用范围 尽管如此 由于该系统具有简单 实用及价格低廉等特点 国内外仍有不少应用该系统成功进行细胞大规模扩增的研究报道 例如 wernera 2000年 成功地在该系统内进行了肝细胞大规模扩增的研究 2 灌注式生物反应器系统灌流培养是目前研究热点之一 它的特点是不断地加入新鲜培养基以及不断地抽走含细胞代谢废物的消耗培养基 使细胞得以在一个相对稳定的生长环境内增殖 即省时省力 又减少了细胞发生污染的机会 且可以提高细胞密度10倍以上 3 旋转生物反应器近年来 旋转生物反应器系统 rccs 已经成为应用微载体技术进行细胞大规模扩增的一种较常用细胞培养系统 该系统是基于美国航空航天局为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器 rccs既可以用于微载体大规模细胞培养 又能在其内培育细胞与支架形成的三维空间复合体 至今 近百种组织细胞均在该系统内成功进行了大规模扩增 第三节优良的微载体应具有的特征 细胞能否在微载体表面附着生长并扩展成单层取决于细胞的特性 微载体理化性质 培养基成分及培养条件 而微载体性能的优良与否是关键的因素 它不仅影响培养细胞的形态 贴壁率 生长速率 细胞密度以及是否容易收获细胞或其分泌产物 乃至于产物的整个生产成本 微载体的基质 琼脂糖是一种天然多糖 一般不能支持细胞生长 如控制熔融后的冷却速率 使凝胶缓慢生成 则琼脂糖链形成双螺旋似纤维状结构 这种结构的琼脂糖能支持细胞在其表面上附着生长 电中性的葡聚糖不能支持细胞生长 而用deae或季胺基团修饰的带有适量正电荷的交联葡聚糖能支持细胞生长 聚苯乙烯由于表面的憎水性 不易被培养基浸润 细胞难以在其表面附着 若用氧化剂 如高氯酸 高锰酸钾等 进行表面处理或用紫外线照射 电晕放电进行表面处理 使其表面产生亲水的羧酸 细胞就容易附着生长 聚苯乙烯由于表面的憎水性 不易被培养基湿润 细胞难以在其表面附着 若用氧化剂 如高氯酸 高锰酸钾等 进行表面处理或用紫外线照射 电晕放电进行表面处理 使其表面产生亲水的羧酸 细胞就容易附着生长 优良微载体须具备以下特征 1 微载体须不含毒害细胞的成分2 微载体徐与细胞有良好的相容性 使细胞容易贴壁3 微载体的密度应略大于培养基4 微载体粒径5 具有良好的光学透性6 高温灭菌7 基质应是非刚性材料8 不吸收培养基中的营养成分9 收获细胞或细胞制品容易10 价格 第四节国外微载体研制现状及发展趋势 微载体是单层培养与悬浮培养相结合的方法 细胞对载体介质是贴壁静置培养 但载体介质又处于悬浮状态而使细胞处于悬液培养基中 该方法具有操作简便和不易污染的优点 利用此法已成功地用猴肾细胞 vero细胞 生产疱疹病毒疫苗和用培养的人二倍体细胞 人胚肺 生产出人 干扰素 此外还培养了狗肾 兔肾 牛肾细胞 鸡胚纤维母细胞 wi 38 mrc 5 bhk21 iup 90 f10w 2002 人包皮fs 4二倍体细胞 鼠胚 猩猩肝成纤维细胞等传代细胞 最早使用离子交换凝胶 deae sephadexa50 作为载体 轻微搅动即可悬浮在培养基中 由于这种微载体带有电荷 利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖 载体处于悬浮状态时 这样既可大大增加细胞附着面积 又使细胞能与培养基充分接触 进而有利于细胞的生长 因此能达到大量培养细胞的目的 对载体进行了改良目前使用的载体主要有三种类型 它们都是带有不同基团的葡聚糖交联而成的大分子 分别为 型 cytodex1 2 3 由于微载体所带有的基团不同 就决定了它们之间的差异 i型载体是整个载体带正电荷 ii型仅表面带有正电荷 型不带有电荷 其外表面被胶原层包裹 胶原是豚鼠皮肤的提取物 同样适于细胞附着和生长 一 交联葡聚糖作基质的微载体 1 deae sephadexa50环氧氯丙烷交联的珠状葡聚糖sephadexg50表面 接上deae di ethy1amin0ethy1chloride 即是deae sephadexa50 是pharmacia公司商品 vanwezel首先使用这种微载体贴壁培养了动物细胞 并取得了初步成功 在试验中vanwezel也发现 这种微载体使用浓度如培养基超过1g l 对细胞贴壁生长产生了 毒性 效应 具体表现在有50 75 原始接种细胞损失掉了 并延缓了细胞贴壁时间 如浓度超过2g l培养细胞的损失量更大 同时细胞生长也受到了抑制 horng等人认为其 毒性 效应可能是微载体吸附培养基中生长因子和关键营养物质造成的 为了降低微载体 毒性 已使用了各种方法 其中有 用血清 火棉胶或羧甲基纤维素预处理 提高接种的细胞量 或加旧培养基于细胞生长培养基中等等 采用这些方法 虽能缓解微载体的 毒性 但改进不大 1977年levine等人 通过减少接在sephadexg50上deae的量 即减少正电荷量 来降低微载体的毒性就是根据这一概念 他们合成了阴离子交换量为2ml g的微载体 命名为mit 微载体 这种微载体使用浓度可达5g l培养基 没有发现对生长有 毒性 效应和延缓细胞贴壁的现象 pharmacia公司也合成了阴离子交换量为1 5ml mg的微载体 即商品名cytodex1 从以上情况 作为培养贴壁依赖细胞的微载体deae sephadesa50已被淘汰了 2 cytodex1 微载体合成 是将带正电荷基团的deae氨解交联到葡聚糖的羟基上形成串联基团 其结构为交联葡聚糖 这种微载体不同于其他微载体之处 在于微载体整体中都有电荷基团 如在合成cytodex1时 通过控制反应条件 可使带正电荷基团的量减少到15 左右 这一带正电荷基团的量 既能提高基团的稳定性和均匀度 也能降低基团从微载体上丢失的可能性 cytodex1是当前用途最广的一种微载体 能适应培养的细胞类型不下60余种 3 cytodex2 微载体合成 是用带正电荷基团的n1 n2 n3 三甲基 2 羟基 胺基 丙烷 n1 n2 n3 trimethy1 2 hydroxy1aminopropy1 由于是用季胺取代 故不会形成串联基团 带正电荷季胺基团 在微载体基质上分布均匀 结合牢固 在细胞培养条件下非常稳定 控制细胞贴壁速度是带正电荷的表面层 cytodex2所带的正电荷密度 远低于cytodex1 基本上不吸收培养基中成分 细胞代谢产物和细胞生化制品 这种微载体特别适用于生产病毒和用原代细胞或成纤维二倍体细胞生产生化制品 4 cytodex3 微载体合成 是在交联葡聚糖表面上化学偶合一层变性胶原 偶合量为60 g cm2 cytodex3常被选用作体外贴壁培养困难的细胞的微载体 特别是对上皮形态细胞的贴壁培养 更有其独特的优点 其他细胞如肝细胞 成纤维细胞 软骨细胞 成肌细胞等 也用这种微载体进行过常规培养 cytodex3有很大优点 是用各种水解蛋白酶特别是胶原酶很容易消化细胞 微载体 把细胞从载体上剥脱下来 活细胞收获量相当高 二 纤维素为基质的微载体 deae 纤维素微载体 de 52 de 53 英国whatman生产的微圆柱体deae 纤维素 de 52 de 53 原先主要用作液相色谱柱载体 后经reuveny研究 结果表明这种载体也能用作增殖多种贴壁依赖的细胞和生产生物制品 这类微载体是阴离子交换型 具有以下的独特性质 1 圆柱形 有较大的表面积 体积之比 2 与珠状叔胺衍生的微载体相比 它的表面积 体积之比小 故吸附培养基中成分相对地也较少 3 与珠状叔胺衍生的微载体相比 细胞贴壁和扩展速率快 4 比其他商品微载体价廉 确立细胞系细胞 在de 52 de 53微载体上是单层生长 当细胞完全覆盖微载体表面时 细胞能彼此吸附形成细胞桥 这一现象在de 52微载体上特别明显 因离子交换量低 单层培养中 细胞能生长成圆形趋势 例如aedesaegypi细胞系 人腺癌细胞系 在deae 纤维素微载体生长成细胞 微载体聚团 这些细胞都难以在珠状微载体上生长 原代细胞 cef 鼠神经培养 鼠肌细胞 在deae 纤维素微载体上也能生长成细胞 微载体聚团 细胞重叠成若干层 聚团中心细胞所需营养物 由培养基流过载体微孔来提供 这是多孔性微载体在高密度细胞培养中的一大优点 在这类微载体上培养cef细胞和病毒 能得到较高产率 但cef只在de 53微载体上生长 说明微载体的离子交换量 对某些细胞生长 有很大影响 培养神经细胞和肌肉细胞都能获得较高产率的成熟细胞 但来自二倍体细胞株 在这类微载体上难以生长 hela和namalwa细胞在deae 纤维素载体上都能迅速生长 用纤维素作基质合成的微载体 可以根据需要作成圆柱形 珠形和纤维形 它对贴壁依赖的细胞生长有特殊功能 例如为了降低deae sephadexa50高正电荷的毒性效应 有时也可用火棉胶涂抹载体表面 纤维素微载体基础原料来源容易 合成程序不复杂 培养的细胞类型范围广 是一种很有价值 值得开发的微载体 三 蛋白质作基质的微载体 明胶微载体 用明胶水溶液与疏水性有机液体如矿物油 明胶混合即聚结成微珠 继用戊二醛交联 最后用nabh4 硼氢化钠 还原 即得到淡黄色明胶微载体 这种微载体 具有优良的表面性质和光学性质 比重略大于水 基质是非刚性 无毒 能与多种细胞自然配位结合 特别是培养上皮形态细胞 如用其他基质微载体 收获细胞非常困难 但用明胶微载体时 用胶原酶消化细胞 微载体 明胶即完全溶解于消化液中 游离细胞悬浮在液体上层 收获很容易 且活细胞收率可达98 所以 明胶微载体 是培养贴壁依赖细胞的一种优良微载体 grachev用他合成的明胶微载体 命名为cytolar 培养小鸡胚胎细胞 肾细胞和人胚胎二倍体成纤维形细胞 并与商品cytodex3进行培养对比 以培养人胚胎二倍体成纤维细胞为例 两种微载体细胞贴壁率相当 均为84 90 但明胶微载体接种细胞2 3小时后 细胞即开始在载体表面上扩展 5天后 细胞生长成密的单层 细胞形态仍保持成纤维形 而cytodex3微载体 在相同时期内 细胞没有在载体表面上形成单层 并有相当多的细胞变为多边形 wissemann用他合成的明胶微载体培养小鼠成纤维细胞 l 929 人宫颈癌细胞 hela 猪睾丸细胞和人静脉内皮细胞 细胞在微载体上生长速率与组织培养瓶相当 培养后的细胞 微载体 用胶原酶溶液消化15 20分钟 明胶微珠即全部溶解 corningglassworks新近修饰了明胶基质 合成新的明胶微载体 它能支持人成纤维细胞 mdck vero 猪睾丸等细胞贴壁生长 培养后的细胞 微载体 用0 13 0 2 胰蛋白酶或0 4 dispase溶液消化12分钟 明胶珠即完全溶解 kohem用化学方法修饰胶原微珠上的胺基或羟基基团 使其带正电或负电荷 用于培养乳腺细胞 能提高细胞的贴壁速度 明胶微载体 细胞贴壁 生长和收获都容易 它的缺点是能吸附或捕捉培养基中有效营养成分 特别是血清 四 高分子合成材料为基质的微载体 1 聚苯乙烯微载体 biosilon 用聚苯乙烯基质作动物细胞培养的载体 早已使用过 实验室常用的塑料组织培养盘或瓶的材质大部分是取苯乙烯 经表面处理和组织处理后 能使动物细胞优化生长 biosilon微载体 biosilon微载体适应培养的细胞型相当广 其最大的优点是不摄取培养基中一样成分特别是血清 因而能制备高纯度生物制品 且经适当处理后可反复使用 但biosilon也存在一些缺点 1 与带正电荷微载体相比贴壁速度慢 2 由于材质刚性结构 在搅拌条件下微珠与微珠间的碰撞容易损伤细胞 3 由于微珠是无孔的 需较高的转速方能使微载体均匀悬浮在培养介质中 2 聚苯乙烯 二乙烯苯微载体这类微载体有三种 即带负电荷的 磺化过的 载体 带正电荷的 用聚乙烯亚胺涂抹 载体 和胶原涂抹的 这些微载体用于研究内皮细胞和hela细胞的超微结构和生化特性优于其它一些商品微载体 3 聚甲基丙烯酸羟乙基酯微载体 聚甲基丙烯酸羟乙基酯是一种无毒性 无抗原性 生物相容性好的高聚物 因而可用作微载体的基质 但聚甲基丙烯酸羟乙基酯不能与纤维黏连蛋白结合 故不能支持细胞贴壁和生长 为此在聚合时添加少量憎水性单体甲基丙烯酸酯和少量带电荷的单体二甲基乙胺基甲基丙烯酸酯使之共聚来改善表面性质 以利于细胞附着生长 4 聚乙烯基吡啶微载体 将4 乙烯基吡啶与苯乙烯 二乙烯基苯通过悬浮共聚可制得适合细胞培养的微载体 成珠后勿需化学修饰即可用于培养 该微载体的主要优点是光学透明性好 不吸收培养基 稍加处理即可重复使用 5 聚丙烯酰胺微载体伯胺衍生的聚丙烯酰胺微载体用微载体系统培养动物细胞 在大部分研究和开发工作中 都把重点指向优化微载体培养系统所涉及的各种因素 很少研究微载体表面的化学性质对细胞培养行为的影响 reuveny等人研究了聚丙烯酰胺衍生的微载体 得出以下有意义的结论 1 携带电荷量的重要性与叔胺衍生的微载体相比 在低的离子交换能力下 伯胺衍生的微载体能支持细胞贴壁 生长和扩展 2 细胞类型比较几种细胞类型在伯胺衍生的微载体上的生长情况 得出 成纤维细胞 cef mrc 5 在叔胺衍生的微载体上生长比伯胺衍生的微载体好 上皮形态细胞 mdck mdbk 恰好相反 3 疏水性当碳原子为4 6的碳氢化合物两侧链上接有带电荷的伯胺基团时 决定疏水性参数 细胞能在表面优化生长 如微载体基质上引进疏水性基团 10 甲基丙烯酰胺置换聚丙烯酰胺 时 细胞产率明显下降 reuveny根据以上研究结果开发了新的微载体二胺基已烷聚丙烯酰胺 它的离子交换能力为0 3 0 9ml g干珠 与叔胺衍生的微载体比较 有以下优点 1 细胞贴壁和扩展速度较快 2 上皮形态细胞产率较高 3 成纤维形细胞产率与叔胺衍生的微载体相当 4 细胞能在低电荷下增殖 可能是由于从培养基中吸附血清蛋白的量降至最低的原因 5 微载体价廉 由以上情况看来 二胺基已烷衍生的聚丙烯酰胺微载体 很有可能替换通用的叔胺衍生的微载体 衍生的聚丙烯酰微载体 是塑料基质微载体应用比较广的一种 它的制备方法 包括聚丙烯酰胺 paa 在内 文献中已有报道 6 硅橡胶微载体 硅橡胶载体是将未硫化的硅橡胶液 滴到与硅橡胶不溶的凝固液中成珠 然后将珠加热或用紫外照射使之硬化 即成硅橡胶微载体 它用于培养detrict551二倍体细胞 经五天培养 细胞增殖比达4 5倍 其它 衍生的聚苯乙烯微载体这种微载体与表面经过组织处理的苯乙烯恰相反 它是用带正电荷基团交联苯乙烯 二乙烯苯制备的微载体 深层培养原代细胞和二倍体细胞 已成功地在这种微载体表面上增殖 聚甲苯乙烯微载体聚苯乙烯微载体 具有溶胀率低 机械强度高 粒径分布窄的优点 但细胞贴壁不完全 表面上生长的细胞分布不均匀 微珠容易沉降 为了克服这些缺点 开发了二乙烯苯交联的聚甲苯乙烯微载体 这种微载体经试用培养bhk细胞 sa7成纤维形细胞和vh2成纤维细胞 并与cytodex1比较 使用离子交换量为1 4ml g的聚甲苯乙烯微载体 bhk sa7和vh2细胞 细胞在微载体表面上贴壁生长数 高于通用的cytodex1微载体 其它塑料基质微载体其它塑料基质微载体如聚甲基丙烯酸酯 聚丙烯酸酯 聚乙烯醇等微载体 也曾研究用于动物细胞培养 其中亲水性聚乙烯醇可直接用于细胞培养 而疏水性聚甲基丙烯酸酯需经过纤粘素 糖蛋白或胶原进行表面处理 方可使用 多糖类作基质的微载体 甲壳质 zjchitin 虾皮蟹壳等废弃物 经酸碱处理 脱去其中石灰质和蛋白质 即得到甲壳质 将溶于有机溶剂中的甲壳质溶液分散到水 甲醇 乙醇等凝固液中 甲壳质即聚结成微珠 微粒大小 由分散口大小来调节 甲壳质的化学结构 n 乙酰基 d 氨基葡糖 以 4化学键直接联接的链状多糖 有多种用途 甲壳质微珠 除用作气 液相色谱柱载体外 预期也是贴壁培养动物细胞的优良载体 但研究不多 五 无机材料玻璃作基质的微载体 1 中空玻璃微载体玻璃是贴壁培养动物细胞的优良基质 如表面再经过血清 鱼精蛋白等组织处理 优化培养的细胞类型非常广泛 用玻璃基质加工成大量培养动物细胞的载体 一般都是球状 球径大小随培养模式不同而异 如是固定床培养 玻璃珠直径为3mm 一般可用作大量培养多种细胞 如是悬浮培养 微载体的粒度在100 150 m 因玻璃微珠比重大 轻度搅拌难以使其均匀地悬浮在培养基中 一般可采用下列方法来降低微珠的比重 下页 1 加工成比重1 04左右的空心珠 2 用腐蚀液浸蚀 加工成比重1 03 1 09的多微孔类似泡沫体的微珠 3 用聚苯乙烯作母体 表面沉积一层玻璃 得到比重在1 03 1 2的微珠 2 明胶涂覆的多孔微载体多孔玻璃微珠用明胶涂覆再用戊二醛交联 或用偶联剂 氨基丙基三乙氧基硅烷 将明胶偶联在玻璃微珠表层 所得微载体性能更好 用它培养rfc细胞 大鼠原代成纤维细胞 接种3h后 几乎所有细胞都贴附在载体表面 细胞增殖速率比通用单层培养高9 8倍 玻璃基质微载体优点 1 一般细胞系包括人二倍体成纤维细胞在内 都