基因工程B.doc

20102011学年 第一学期 基因工程期末考试 复习要点整理基因工程复习要点名词解释：天然DNA：存在于生物体内的DNA，包括染色体DNA、质粒DNA、病毒(噬菌体)DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA。其中绝大部分是双链DNA，部分病毒和极少数质粒是单链DNAPCR(polymerase chain reaction):模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，在体外由酶催化合成特异性DNA片段的反应。限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)：能专一性的识别双链DNA上的特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的一类内切核酸酶。同尾酶(isocaudamer):切割DNA分子所得的DNA片段具有相同的粘性末端的限制性内切核酸酶。同裂酶(isoschizomer):来源不同，但具有相同的识别序列的限制性内切核酸酶。限制性图谱(restriction map):DNA分子(片段)上的限制性内切核酸酶的识别序列的分布图称为Star活性：某些限制酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA的现象。DNA连接酶(DNA ligase):催化DNA链的相邻3-羟基和5-磷酸基团发生缩合反应，形成磷酸二酯键的酶。克隆载体：一种具有携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并使其在受体细胞中得以维持或表达的功能的DNA分子。质粒(plasmid)是存在于细胞内染色体之外的外链DNA分子，一个质粒就是一个DNA分子质粒表达载体：在质粒载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因的克隆载体。人工染色体载体：是含有质粒载体所必备的第一受体源质粒复制起始位点(ori)和第二受体染色体DNA着丝点、端粒及复制起始位点序列，且含有合适的选择标记基因的一种“穿梭”基因载体。基因组文库：贮存了某种生物基因组的DNA序列的一个受体菌群体。cDNA基因文库：某种生物材料的基因转录产物mRNA经逆转录形成不同的cDNA片段，与克隆载体重组后贮存在受体菌群中，这样的群体就是cDNA基因文库。反向PCR(inverse PCR):利用两个靶序列引物对未知片段进行常规扩增的PCR技术。长程PCR(LA PCR):一种超长DNA片段的PCR扩增方法。Alu PCR：根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR方法。受体细胞(receptor cell):又称宿主细胞或寄主细胞，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。人体胚胎干细胞(ESC)是一种高度未分化细胞，是受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团的细胞，它具有体外培养无限增值、自我更新和多向化的特性，几乎能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。转化(transformation)：是指重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持与表达的过程。转导(transduction)：是指通过噬菌体颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。转染(transfection)是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。分子探针(molecular probe)：具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质分子。克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程。基因沉默(gene silencing)：(P261)基因组(genome)指单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组生物芯片（biochip）采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序的固化于支持物的表面，组成的密集二维分子排列。基因芯片（genechip）采用原位合成或显微印刷技术，将数以万计的DNA探针分子固定于支持物的表面上，产生的二维DNA探针列阵。绪论基因工程理论基础：不同的基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可以转移的多肽与基因之间存在对应关系遗传密码是通用的基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代基因工程技术基础：限制性内切核酸酶DNA连接酶基因克隆载体基因转移技术基因工程的技术路线：（P4）应用研究：基因工程药物研究转基因植物研究转基因动物研究其他：酶制剂、食品、化学与能源第一章 核酸的制备双链DNA是靠互补配对的碱基之间的氢键维持的天然DNA分子有的以线形存在，有的以环状存在： 几乎所有真核生物和部分原核生物染色体DNA以线形存在； 大部分原核生物染色体、线粒体、叶绿体以及细菌的质粒都是环状DNA分子； 病毒和噬菌体中有的含线形DNA，有的含环状DNA。动物体样品保存：冷冻保存乙醇保存甲醛保存裂解细胞的方法：化学法：CTAB裂解法SDS裂解法酶裂解法：蛋白酶K裂解法溶菌酶裂解法物理法：研磨破碎法液氮冻融破碎法煮沸破碎法微波破碎法超声波破碎法DNA分离和抽提：酚-氯仿抽提法(P31)DNA的纯化：琼脂糖凝胶电泳洗脱法DNA的浓缩：乙醇沉淀法正丁醇抽提法用聚乙二醇浓缩法PCR(polymerase chain reaction)PCR的基本原理：以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板DNA一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是：反应系统加热至9095，底物双链DNA变性成为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；降温至3760，使两种引物分别与模板DNA链的3端一侧的互补序列杂交(复性)；升温至7075，耐热性DNA聚合酶催化引物按5 3反向延伸，合成模板DNA链的互补链。进行PCR的主要条件：耐热性DNA聚合酶靶DNA和模板PCR引物PCR原料PCR缓冲液PCR循环的温度和时间PCR扩增平台期凝胶电泳检测核酸的基本原理：核酸分子在中性或偏碱性的缓冲系统中带负电，在电泳过程中，处于凝胶靠负极端的核酸分子(片段)通过凝胶分子筛向正极端移动，迁移率与核酸分子(片段)的构型和大小相关，经适当的电泳时间后，可使不同构型和大小的核酸分子(片段)分散，处于一定的位置。再用相关指示剂处理凝胶，在一定波长的紫外光照射下可观察到核酸分子(片段)在凝胶中所处的位置，显示出待检测核酸样品的凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶电泳：用琼脂糖制备的凝胶电泳，主要用于检测DNA分子(片段)，可检测70bp(3凝胶)至80kb(0.1凝胶)长度的双链DNA片段聚丙烯酰胺凝胶电泳：用聚丙烯酰胺制备的凝胶电泳，主要用于检测6bp(20凝胶)至1kb(3凝胶)长度的双链DNA片段溴化乙锭染色和紫外观察(只需了解P52)Sanger双脱氧链终止法测序的原理：DNA聚合酶能够利用单链DNA作模板，合成出对应的DNA互补链，但在反应过程中，如果2,3-双脱氧核糖核苷三磷酸底物掺入到寡核苷酸链的3端，DNA链的延伸反应即被终止。第二章 基因工程工具酶限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)限制性内切核酸酶作用机制：限制酶以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基(OH)和5-磷酸基(P)的DNA片段。限制性内切核酸酶的识别序列：EcoR GAATTC CTTAAGBamH GGATCC CCTAGGHind AAGCTT TTCGAA同尾酶(isocaudamer) 同裂酶(isoschizomer)影响限制酶切割效率的因素：DNA纯度：纯度低效率低；纯度高效率高DNA分子构型：切割线形DNA分子效率高于超螺旋和环状DNA分子识别序列的侧面序列：侧面序列越长效率越高但也有例外位点偏爱:不同位置的识别序列切割效率有差别(与两侧的核苷酸组成有关)DNA甲基化：甲基化会影响切割效率，但也可保护DNA不被切割Star活性 限制性图谱(restriction map)限制酶切割核酸分子的方法：单酶切法双酶切法部分酶切双酶切法比单酶切法有哪些优点？(P74)DNA连接酶(DNA ligase) 常用的DNA连接酶有哪几种？有何不同点？ E.coli DNA连接酶：能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，但不能催化双链DNA片段平末段之间的连接；反应系统中必须含NAD作为辅助因子 T4DNA连接酶：可催化双链DNA片段互补粘性末端和平末端，但平末端连接效率较低；反应系统中必须加有辅助因子ATP Tsc DNA连接酶：可催化两个双链DNA片段末端紧相邻的相邻3-羟基和5-磷酸基之间形成磷酸二酯键，但在90以上高温短时间处理后仍保持酶活性常见的DNA聚合酶有：耐热性DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 T4噬菌体DNA聚合酶 逆转录酶细胞裂解酶有：溶菌酶 蛋白酶K 纤维素酶第三章 基因克隆载体克隆载体 克隆载体的种类：质粒、噬菌体或动植物病毒DNA分子改造后的产物。基本条件：针对受体细胞的可转移性自主复制功能显著的筛选标记特定的多功能位点安全性质粒(plasmid) 质粒表达载体构建质粒克隆载体的策略(P106)能在受体细胞中进行有效的复制，并有较多的拷贝数；含有外源DNA片段克隆的位点，且越多越好；含有供选择克隆子的标记基因；载体DNA分子应尽可能的小；构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件。TA载体：用于将PCR产物以TA连接的方式直接进行克隆(TA克隆)的载体。M13噬菌体载体：利用一种丝状噬菌体M13噬菌体构建的克隆载体。应用：主要用于克隆和分离单链外源DNA片段Cosmid载体：由质粒和含有COS位点的小DNA片段组装而成的一类新克隆载体。特征：Cosmid载体是一种环形双链DNA分子，不超过36.4kb，一般小于10kb；具有质粒性质，可以像质粒载体一样承载外源DNA片段，转化大肠杆菌受体细胞，并在其中自行复制和增殖；含有一个cos位点；能承载比较大的外源DNA片段。人工染色体载体常见的人工染色体载体有酵母人工染色体载体细菌人工染色体载体P1人工染色体载体第四章 目的基因的分离与修饰原核生物基因的组成 基因区：原核生物的基因多数以操纵子形式存在，即完成同类功能的多种基因聚集在一起，处于同一个启动区的调控之下，下游同具一个终止子。启动区：是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA核苷酸序列。SD区：在起始密码子序列ATG上游约10bp处的一个富含嘌呤的保守序列区。转录终止子和终止因子：在一个基因的3端或是一个操纵子的3端，提供转录停止信号的DNA核苷酸序列是终止子；协助mRNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)为终止因子。基因的排列：重叠基因重复基因加倍基因基因重排基因组文库 cDNA基因文库cDNA克隆的优越性:以mRNA为原料，是研究某些RNA病毒的基因组结构以及相关基因克隆分离的有效办法；cDNA基因文库的复杂性低、筛选简易；每个cDNA克隆子均含有一种mRNA序列，在克隆子筛选和目的基因分离过程中假阳性概率比较低；真核生物的cDNA克隆序列能在细菌中表达，直接应用基因工程的操作；cDNA克隆还能应用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。反向PCR(inverse PCR) 长程PCR(LA PCR) Alu PCR 第五章 重组基因导入受体细胞 受体细胞(receptor cell)受体细胞的原则:便于重组DNA分子的导入；能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；便于重组体的筛选；遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长；安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含较量低；受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。常见的原核受体细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、蓝细菌原核受体细胞的优点:大部分原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入；没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；原核生物多数为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，而且培养简单、繁殖迅速、实验周期短、重复实验快。酵母是外源真核基因最理想的表达系统，原因在于：酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对较为简单；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性的病毒，不产生毒素，属于安全型基因工程受体系统；培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。哺乳动物受体细胞 常见的：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小仓鼠肾细胞(BHK)、COS细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞等优点： 能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的mRNA；真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，为酵母细胞的1620倍；易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性；经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点：组织培养技术要求高人体胚胎干细胞(ESC) 转化(transformation) 转导(transduction) 转染(transfection) 克隆子的筛选 分子探针(molecular probe)抗药性筛选；显色互补筛选(P232)第六章 外源目的基因表达与调控外源基因mRNA的有效翻译： AUG(ATG)是首选的起始密码子SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基SD序列与翻译起始密码子之间的距离为39个碱基在翻译起始区的周围的序列不易形成明显的二级结构避免外源基因表达蛋白降解：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统基因表达的调控原件：启动子增强子终止子衰减子绝缘子反义子大肠杆菌基因表达载体包括：复制子启动和终止子核糖体结合位点密码子选择标记外源基因在大肠杆菌表达的形式：包涵体蛋白融合蛋白寡聚型外源蛋白整合型外源蛋白分泌型蛋白在大肠杆菌中高效表达目的基因的策略(P275)酵母基因表达载体包括：DNA复制起始区选择标记有丝分裂稳定区表达盒：启动子、分泌信号序列和终止子酵母基因表达载体的种类：自主复制型质粒载体(YRP)整合型质粒载体(YIP)着丝粒型质粒载体(YCP)酵母人工染色体(YAC)哺乳动物基因表达载体的组成