δ-连环素在糖尿病大鼠海马神经元中的表达.docx

【摘要】 目的 观察-连环素在大鼠糖尿病模型海马神经元中的表达特征。方法 根据实验需要将大鼠随机分成糖尿病组、正常对照组和缓冲剂组。按45 mg/ kg一次性尾静脉注射链脲佐菌素(溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液)诱发糖尿病,缓冲剂组只给予等量的缓冲液。应用免疫组织化学方法观察海马神经元的形态结构变化，并应用计算机图像分析技术检测-连环素在各组中的定量表达。结果 糖尿病组大鼠海马神经元中-连环素表达明显低于正常对照组和缓冲剂组，在海马齿状回减少尤为明显。结论 糖尿病可下调大鼠海马神经元中-连环素的表达。 【关键词】 -连环素;糖尿病;海马;大鼠;免疫组织化学Abstact：Objective To investigate the characteristics of the expression of -catenin in diabetic rat hippocampal neurons. Methods The rats were randomized into diabetic, normal control and buffer groups. The rats in the diabetic group were injected with a single dose of 45 mgkg of STZ (dissolved in 0.1 mol/L sodium citrate buffer) via the caudal vein to induce diabetes mellitus, and the animals in the buffer group received the same dose of sodium citrate buffer alone. The morphological changes of the hippocampal neurons were observed by immunohistochemical method and the quantitative expression of -catenin in each group was determined by computer-assisted image analysis system. Result Immunohistochemical method and quantitative assay revealed that the expression of -catenin in the diabetic group was the lowest in the three groups, particularly in the dentate gyrus (DG). Conclusion The diabetic functional disorders of the central nervous system may downregulate the expression of -catenin.Key words：-catenin; diabetes; hippocampus; rat; immunohistochemistry糖尿病神经病变是糖尿病常见的慢性并发症之一，可引起认知功能障碍及大脑的神经生理和结构改变1-2。海马是与脑高级功能相关的重要结构，在糖尿病患者中易受到损害，表现为更易发生中风、痴呆和认知减退3。-连环素属于P120-catenin蛋白家族，特异性地表达在神经元4。研究发现-连环素过表达能诱导细胞形成树突状突起，并增加原代海马细胞中树突的形成5。已有报道-连环素基因变异小鼠表现出严重的学习障碍、突触可塑性降低和突触成分的改变。糖尿病患者认知功能减退的机制至今不明，在糖尿病动物海马神经元中-连环素的表达变化也鲜有报道。1 材料和方法1.1 动物分组及模型制备 SD雄性大鼠，体重 260300 g，徐州医学院实验动物中心提供。随机分成正常对照组、缓冲剂组和糖尿病组(n=9)。按文献6方法，一次性尾静脉注射链脲佐菌素45 mg/kg(溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液),缓冲剂组只给予等量的缓冲液。3天后测血糖，血糖16.7 mmol/L,饮水及尿量明显增多为造模成功。造模成功后常规饲养60天，中间不进行胰岛素干预，也不进行糖尿病饮食控制，造模后每周监测血糖。每组取9只大鼠5%茂巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏先灌注100 ml的生理盐水后灌注4%多聚甲醛0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH7.3配制固定30 min。动物静置于4冰箱3 h后取大脑，用上述固定液后固定约6 h(4)。并修取含海马脑段，经20%蔗糖-PBS液沉底后，-20恒冷切片机切片，片厚20 m。每个动物均依次等距离间隔选取切片,贴片。1.2 血糖测定 造模3天和取材前内眦静脉取血测血糖,血糖测定采用葡萄糖氧化酶法血糖试剂盒。1.3 SABC法免疫细胞化学反应 切片经：300 mg/L H2O2 20 min;4%牛血清白蛋白(4%BSA)封闭，37 30 min;-连环素1200，4 18 h后，室温孵育6 h;生物素标记IgG 1300，室温孵育2 h;SABC复合物1300，室温孵育1 h;3 mg/L H2O2和5 mg/L DAB显色，显微镜下观察，出现阳性颗粒后终止反应。反应步骤过程中，每步后均用0.01 mol/L PBS，pH 7.3漂洗3次，每次10 min。切片经乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。1.4 海马齿状回DG区-连环素阳性反应产物吸光度测定分析 每只动物各取进行过SABC反应的不相邻切片6张(间隔20 m)。400倍的高倍镜下，在海马DG区随机选取10个视野，采用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统对各组-连环素反应阳性的细胞进行吸光度的半定量分析。实验数据用t检验进行统计处理。1.5 统计学方法 所有结果用SPSS 12.0分析。各组之间差异用单因素方差分析检验。再用Student-Newman-Keuls进行两两比较，结果用s表示。P0.05表示在统计学上有显著性差异。2 结 果2.1 大鼠海马区-连环素的表达 结果显示-连环素免疫反应阳性产物呈棕黄色细颗粒状，在海马各亚区的神经元胞质和胞膜中均有表达。显微镜下观察到，正常对照组(图1B，E)和缓冲剂组(图1C、F)大鼠海马神经元中的-连环素免疫反应的阳性颗粒色深密集，均明显高于糖尿病组(图1A、1D)。在海马齿状回(DG区)-连环素主要表达于颗粒层和颗粒下层，少量表达于门区。大鼠海马齿状回-连环素的表达在糖尿病组减少更加明显。正常对照组和缓冲剂组间大鼠海马神经元中-连环素的免疫反应差异不明显。图1 -连环素catenin在各组大鼠海马神经元中表达其中A(40)和D(400)为糖尿病组，B(40)和E(400)为正常对照组，C(40)和F(400)为缓冲剂组2.2 海马齿状回(DG)-连环素阳性反应产物吸光度测定分析 正常组和缓冲剂组海马神经元中-连环素吸光度(absorbance)(A)无明显差异，但分别高于糖尿病组304%和291%，其差别具有显著性意义。见表1。表1 各组大鼠海马齿状回神经元中-连环素表达的定量分析结果3 讨 论本实验发现-连环素在糖尿病组海马神经元中的表达低于正常对照组和缓冲剂组，提示大鼠糖尿病的神经性损害对海马神经元-连环素的表达产生了下调作用。文献报道在糖尿病小鼠大脑中海马神经元的发生不足，数量降低。DG区海马神经元的发生可能与一定的记忆相关7。我们在实验中发现糖尿病组大鼠海马各亚区神经元变大肿胀，空泡样变，胞膜破损，及-连环素在DG区表达明显减少，表明-连环素表达的减少在糖尿病大鼠认知和学习记忆功能减退方面可能发挥一定作用。-连环素参与钙黏连蛋白-连环素复合体的构成，在突触后膜与包括PSD95在内的PSD蛋白组分相互作用，并且在C末端包含1个PZD结合序列8。信号复合体(signalosome)是近年发现的激素对细胞进行调节的一种组合模式。已有文献报道，雌激素与PSD95对神经元突起和突触的结构调控，正是通过信号复合体的模式进行的9，在这一过程中，雌激素与PSD95形成signalosome。当雌激素与PSD95形成signalosome后能够对神经元突起和树突棘生长产生调控作用。推测由糖尿病胰岛素降低而产生上述实验结果的原因可能也是通过这种方式。另外在突触后膜-连环素也可能通过PZD结构域在不同的亚细胞区域与其他的蛋白相互作用8，10，而胰岛素的降低可能促进了-连环素与其他的蛋白的相互作用，从而改变突触塑型，进而引起认知功能和学习记忆功能减退。关于-连环素在糖尿病神经损伤过程中的分子生物学机制还需要进一步深入的研究。【参考文献】 1 Stranahan AM, Arumugam TV, Cutler RG, et al. Diabetes impairs hippocampal function through glucocorticoid-mediated effects on new and mature neurons J. Nat Neurosci,2008,11(3):309-317.2 柏凤,俞伟男.血糖波动与糖尿病慢性并发症J.徐州医学院学报,2009,29(2):137-140.3 Beauquis J, Roig P, De Nicola AF, et al. Neuronal plasticity and antidepressants in the diabetic brain J. Ann N Y Acad Sci,2009,1153(1):203-208.4 Kosik KS, Donahue CP, Israely I, et al. Delta-catenin at the synaptic-adherens junction J. Trends Cell Biol,2005,15(3):172-178.5 Huang CM, Miyamoto H, Huang RH. The mouse cerebellum from 1 to 34 months: parallel fibers J. Neurobiol Aging,2006,27(11):1715-1718.6 Baydas G, Sonkaya E, Tuzcu M, et al. Novel role for gabapentin in neuroprotection of central nervous system in streptozotocin-induced diabetic rats J. Acta Pharmacol Sin,2005,26(4):417-422.7 Shors TJ, Townsend DA, Zhao M, et al. Neurogenesis may relate to some but not all types of hippocampal-dependent learning J. Hippocampus,2002,12(5):578-584.8 Arikkath J, Israely I, Tao Y, et al. Erbin controls dendritic morphogenesis by regulating localization of delta-catenin J. J Neurosci,2008,28(28):7047-7056.9 Nash JE, Johnston TH, Collingridge GL, et al. Subcellular redistribution of the synapse-associated proteins PSD-95 and SAP97 in animal models of