食品安全与卫生学实验设计.doc

食品安全与卫生学实验设计（09级食品质量与安全专业）分组号:7设计者:魏俊潇参与者:邓捷冷嘉璐李笑曼时 间:12.05.14实验一 “鲜肉的质量评价”综合实验设计内容：以市售鸡肉样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、肉品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（pH计测定酸度、硫酸铜法测球蛋白）、微生物检验（大肠菌群国标法1/试管法）、兽药的免疫学快速检测（环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。（勿删）一、实验目的本实验模拟工厂化生产过程，从原料肉的验收、品质评定、产品加工到产品的感官评价，确定产品种类，提出实验设计方案并实施，从中掌握主要肉类产品的基本生产工艺和加工制作方法，以提高解决实际问题的能力。二、实验内容1. 取样方法1.1现场采样用品：采样箱、带盖搪瓷盘、温度计、编号牌或蜡笔、纸1.2禽类取样（包括家禽和野禽）：鲜、冻家禽采取整只，放灭菌容器内。带毛野禽可放清洁容器内，立即送检。；如条件不许可时，最好不超过3小时，送检样时应注意冷藏，不得加人任何防腐剂。检样送往化检验室应立即检验或放置冰箱暂存。2. 感官检验 GB/T 5009.44-20032.1组织形态、色泽、气味将抽取的微生物检验试验后的全部样品，置于自然光或相当于自然光的感官。评定时，用触觉鉴别组织形态，视觉鉴别色泽，嗅觉鉴别气味。2.2煮沸后肉汤的检查称取20g绞碎的试样，置于200mL烧杯中，加入100mL水，用表面皿盖上加热5060，开盖检查气味，继续加热煮沸20min30min，检查肉汤的气 味，滋味和透明度，以及脂肪的气味和滋味，并参见卫生标准。2.3肉眼可见异物：用视觉鉴别，与鉴别组织状态、色泽、气味同时进行。2.4报告项目鲜产品冻产品组织状态色泽气味加热后肉汤淤血以淤血面积（S）计/cm 硬杆毛（长度超过12mm的羽毛，或直径超过2mm的羽毛根)异物注：1.鲜冻禽肉需做淤血和硬杆毛的感官检验 2.淤血面积指单一整禽，或单一分割肉禽的一片淤血面积。3.理化检验3.1肉酸碱度（pH值）测定酸碱度是指动物被宰杀后，在一定条件下，经过一定时间，所测得的pH值，pH值与肉的保水性、嫩度、组织状态及颜色有关，正常动物体的pH值为6.86.9，宰后随糖原酵解逐渐降低。在肉质评定中常测定的pH值有两个，一是宰后45分钟所测得的pH1值，另一个是24小时以后所测得的pH24值。（1）测定方法A、采样 a、测定pH1值的肉样取最后一胸椎处的背最长肌，于宰后45分钟测定。b、pH24值的肉样取头半棘肌，宰后在4左右冰箱存放24小时后测定。B、校准酸度计a、使用前先将酸度计接通电源，预热1时左右。b、把测量选择器调到“pH”档位，并选择pH范围（07）。c、温度调节器置于与被测物近似的位置。d、调节零位，转定位器将指针调到“7”位置。e、接入电极，先将电极插入标准液，调节定位器将指针指到标准液相同的pH值处。用蒸馏水冲洗电极。C、测定pH值a、直接测定法：在肉样中心刺开两孔，将电极插入让肉紧贴在电极触点上，然后读数。b、捣碎测定：把肉样用组织捣碎机捣碎后装在小烧杯中，把电极插入读数，也可加蒸馏水进行。（2）评定评定标准见下表：pH值范围评定结果pH1值6.06.5正常6.5DFD肉特征之一3.2系水力的测定系水力是指肉保持水分的能力，用肌肉加压后保存的水分量占加压前总水量的百分比表示。系水力越高，肉质越好。测定方法与失水率相同，可在失水率测定后直接进行。系水率（%）= 肉样含水率-失水率肉样含水率 100含水率要通过专门测定（烘干法）。3.3挥发性盐基氮（半微量定氮法） GB/T 5009.44-20033.31原理：挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用。在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氮以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出来后，用标准酸溶液滴定计算含量。3.32试剂：氧化镁混悬液（10g/L）：称取1.0g氧化镁，加100mL水，振摇成混悬液。硼酸吸收液（20g/L）。盐酸c(HCl)=0.010mol/L或硫酸c(1/2H2SO4) =0.010mol/L的标准滴定溶液。甲基红-乙醇指示剂（2g/L）。次甲基蓝指示剂（1g/L）。临用时将上述两种指示液等量混合为指示液。3.33仪器：半微量定氮器、微量滴定管：最小分度0.01mL。3.34分析步骤：试样处理：将试样除去脂肪、骨及腱后，绞碎搅匀，称取10.0g,置于锥 形瓶中，加100mL水，不时振摇，浸渍30min后过滤，滤液置冰箱备用。蒸馏滴定：将盛有10mL吸收液及5滴6滴混合指示液的锥形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入吸收液的液面下，准确吸取5.0mL上述试样滤液于蒸馏器反应室内，加5mL氧化镁混悬液（10g/L），迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏5min即停止，吸收液用盐酸标准溶液（0.010mol/L）或硫酸标准滴定溶液滴定，终点至紫色。同时做试剂空白试验。3.35结果结算：试样中挥发性盐基氮的含量按式（2）进行计算。 （V1-V2）c14 X= 100 （2） m5/100式中：X-试样中挥发性盐基氮的含量，单位为毫克每百克（mg/100g）;V1-滴定用样液消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，单位为毫升（Ml）;V2-试剂空白消耗盐酸或硫酸标准溶液体积，单位为毫升（Ml）;C-盐酸或硫酸标准溶液的实际浓度，单位为摩尔每升（mol/L）;14-与1.00mL盐酸标准滴定溶液c(HCl)=0.010mol/L或硫酸标准滴定溶液c(1/2H2SO4) =0.010mol/L相当的氮的质量，单位为毫克（mg）；m-试剂质量，单位为克（g）。计算结果保留三位有效数字。精密度：在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。实验记录:V1V2CX平均值第一个样品第二个样品4.菌落总数测定： GB/T 4789.2-20104.1原理：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。4.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36 1 ，30 1 。冰箱：2 5 。恒温水浴箱：46 1 。天平：感量为0.1 g。均质器。无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。无菌培养皿：直径90 mm。PH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。放大镜或/和菌落计数器。4.3培养基和试剂平板计数琼脂培养基：成分：胰蛋白胨5.0g；酵母浸膏2.5g；葡萄糖1.0g；琼脂15.0g；蒸馏水1000 mL；pH 7.00.2。制法：将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH，分装试管或锥形瓶，121高压灭菌15min。磷酸盐缓冲液成分：磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g；蒸馏水500mL；pH 7.2。制法：贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121高压灭菌15min。无菌生理盐水成分：氯化钠8.5g；蒸馏水1000mL制法：称取8.5氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121高压灭菌15 min。4.4检验程序：4.5操作步骤4.5.1样品的稀释a.称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000r/min均质1min2min，或放入盛有225mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。b.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。c.按5.1.2 操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1mL无菌吸管或吸头。d.根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。e.及时将15mL20mL 冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置于461恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。4.5.2、 培养a.待琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48 h2 h。水产品301培养72 h3 h。b.如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按5.2.1 条件进行培养。4.5.3菌落计数：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。a.选取菌落数在30CFU300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。b.其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。c.当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。4.5.4结果与报告4.6菌落总数的计算方法。a.若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。b.若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。6.1.3、若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。c.若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。d.若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。e.若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU300CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU时，则以最接近30CFU 或300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。4.7 菌落总数的报告a.菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。b.菌落数大于或等于100CFU 时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。c.若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。d.若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。e.称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。4.8报告稀释度1:1001:10001:10000CFU/g平均值第一个样品第二个样品5.大肠菌群 GB 4789.3-2010 大肠菌群MPN计数法5.1原理：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。最可能数，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。5.2设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：361 、冰箱：25、恒温水浴箱：461、天平：感量0.1g、均质器、无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶：容量500 mL、pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。5.3培养基和试剂5.3.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤成分胰蛋白胨或胰酪胨20.0g；氯化钠5.0g；乳糖5.0g；磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75 g；磷酸二氢钾(K2HPO4)2.75g；月桂基硫酸钠0.1g；蒸馏水1000mL；pH 6.80.2；制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。5.3.2煌绿乳糖胆盐肉汤“成分：蛋白胨10.0g；乳糖10.0g；牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液200mL；0.1%煌绿水溶液13.3mL；蒸馏水800mL；pH 7.20.1；制法：将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL（将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，调节pH至7.07.5），用蒸馏水稀释到975mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10mL。121高压灭菌15min。5.3.3磷酸盐缓冲液：成分：磷酸二氢钾(K2HPO4)34.0g；蒸馏水500mL；pH 7.2。制法：贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121高压灭菌15min。无菌生理盐水:称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。无菌1 mol/L NaOH：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中，121高压灭菌15min。无菌1 mol/L HCl：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL，121高压灭菌15min。5.4检验程序：5.5操作步骤样品的稀释a.称取25g样品,放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min10000r/min 均质1min2min,或放入盛有225mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。b.样品匀液的pH值应在6.57.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节。c.用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。d.根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。初发酵试验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），361培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。复发酵试验用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，361培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠菌群最可能数（MPN）的报告按上述确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 5.6 报告稀释度1:1001:10001:10000CFU/g平均值第一个样品第二个样品6.环丙沙星的间接竞争ELISA检测方法1材料1.1主要试剂环丙沙星(CPFX)，中国兽医药品监察所；卵清白蛋白(OVA)，Sigma；牛血清白蛋白(BSA)，Roch；酶标羊抗小鼠IsG，北京中山；其它试剂均为国产分析纯；包被抗原(OVACPFX)，本室合成；CPFX腹水抗体，本室自制。1.2主要器材TECAN酶联免疫检测仪，AUSTRIA；SZ一93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；96孔细胞培养板、96孔酶标板，JET。2.方法21抗原包被时间的选择分别用4。C过夜，37，2 h和1 h 3种方式包被抗原，进行间接ELISA检测，根据阳性及阴性OD值比值(PN)选择合适的包被时问瞄j。22封闭时间的选择将包被好的酶标板用l明胶封闭液在37封闭30 min、1 h和2 h，同时设立不封闭组对照，进行间接ELISA检测，根据WN值选择合适的封闭时间。23包被抗原包被浓度和单抗的工作浓度的选择包被抗原按8、4、 2 、1、05、025、0125、0ug/ml横向包被酶标板，每孔100山，370C，2 h；单抗依次倍比稀释，纵向加入酶标板，其余同间接ELISA检测方法。根据OD值确定包被浓度和单抗的工作浓度。24竞争环境下单抗精确工作浓度的选择以123中确定的包被浓度包被酶标板，标准CPFX按500、100、50、25、5 、10ug/ml稀释横向加入酶标板，每孔50山，同时单抗依123中确定的工作浓度再适当稀释，每孔50心加入酶标板，其余按间接ELISA检测方法。根据抑制效果和OD值选择单抗精确工作浓度。25 竞争时间的选择在上述确定的条件下，分别选择不同的时间，比较间接竞争ELISA的竞争抑制效果。26数据处理与分析261标准曲线的制作：选择6个以上CPFX标准品浓度，用已经建立的间接竞争ELISA检测方法进行检测，以标准品浓度的常用对数为横坐标，以(A标Ao)为纵坐标绘制标准曲线，并根据曲线的具体情况选择最佳的拟合模型。其中凡为零标准品孔OD值，A标为各浓度标准品孔OD值。262精密度的确定：以批内和批间变异系数表示该ELISA方法的精密度。分别设高、中、低3个水平的待测样品，同一样品测定两个批次，每个批次重复测定5次。以每批次内3个水平变异系数的均值代表各批内变异系数，总的批内变异系数为两批次批内变异系数之均值。批问变异系数是将两批次每个水平按10次重复计算变异系数，再取均值。263灵敏度的确定：随机选择10个孔做零标准品间接竞争ELISA检测。求所得10个孔OD值的均值和标准差SD，在标准曲线上对应(氐一2+SD)的标准品浓度即为此方法的灵敏度(最低检测限)。3结果与分析3.1抗原包被时间4。C包被过夜、37。C包被2 h、1 h，其ELISA检测结果的PN值分别为2008、1953、1346。可以看出前两种包被方法基本相同，而后者的PN值较低。3.2封闭时间37包被2 h的酶标板，1明胶37封闭2 h、1 h、30 min和不封闭组的PN值分别为2142、2320、2078、1654，其中以37封闭1 h最佳。3.3 包被抗原包被浓度和单抗工作浓度通过间接ELISA方阵检测，根据OD值应在1015之间，且包被抗原及单抗用量少的原则选择1蜡Inl为最佳包被浓度。同时初步选择腹水单抗的工作浓度为1：16000。3.4竞争环境下单抗的精确工作浓度选择零标准品孔OD值在1015之间，且抑制效果较好的单抗稀释度(1：18000)作为单抗的精确工作浓度。3.5竞争反应时间根据已经确定的反应条件，将竞争反应时间分别设为37，2 h、1 h和30 min。从竞争结果看竞争反应时间的长短对抑制率影响无显著差异。故选择OD值在1015之间的条件37，1 h作为竞争反应的时间。3.6优化的间接竞争ELISA方法程序OVACPFX 1 veml包被酶标板，100少孔，37包被2 h；PBST洗涤3次，每次3 min；1的明胶封闭液，150ul/孔，37，1 h；PBST洗涤3次，每次3 min；腹水单抗18000倍稀释与适当梯度稀释的标准CPFX溶液各50止，在板内竞争反应37，1 h；PBST洗涤3次，每次3 min；酶标羊抗小鼠IgG(1：4000)，100孔，37，1 h；PBST洗涤4次，每次3 min；加入底物溶液，100ul孔，37，20 rain，立即每孔滴加50ul终止液，酶联检测仪测定0D伽值。27标准曲线标准CPFX按500、200、100、50、25、125、625、0 ngml稀释，用已经优化的条件做间接竞争ELISA检测，结果见表1。以标准品浓度的常用对数为横坐标，以(A标)为纵坐标绘制标准曲线见图1。数据用EXCEL分析，曲线拟合方程为l，r= 一36458X+11098(r2=09946)。实验二“生鲜牛乳质量评价”综合实验设计内容：以市售生鲜乳样品为目标，参考课件、食品专业实验指导教材、乳品检验相关教材、相关食品检测国家标，主要针对取样方法、感官检验、理化分析（相对密度、酒精实验法测酸度）、微生物检验（菌落总数、大肠菌群国标法2/平板法、美蓝还原试验）、抗生素检测（嗜热链球菌抑制法/TTC法，乳酸链球菌由实验室提供）、掺假乳实验（掺淀粉、豆浆、碱、盐、甲醛等，可做验证实验）等内容，从实验准备、试剂配制、到完成实验的全过程设计一个详尽合理的实验流程，具体顺序不做要求，但应具体、有可操作性，并在规定的时间内完成上述全部内容，给出实验结果和综合判定。（勿删）一、乳样的采集和保存新鲜牛乳是指从正常饲养的、无传染疾病和乳房炎的健康母牛乳房内挤出的正常乳。采样前必须充分搅拌使混合均匀。采用直径10mm镀镍金属管或玻璃管采样，从不同深度采样。采样量若只测脂肪和酸度时50mL即可，若做全面分析取200300mL，样品应做两个平行。快速冷却保存：05,12天；不做细菌学检验时可加防腐剂保存：每100mL乳加福尔马林12滴可保存1015天；每100mL乳加H2O223滴，密闭，可保存610天。二、感官检验1检验方法1.1色泽:白瓷皿中,检查是否带红色、绿色或明显的黄色；1.2气味: 加热后嗅其气味，不能有苦、咸、涩的滋味和饲料、青贮、霉等其他异常气味；1.3滋味：品尝；1.4组织状态：烧杯中静止一小时，小心倒入另一烧杯，看前一杯底是否有沉淀和絮状物，再取一滴于大拇指上，检查是否粘滑；1.5杂质：是否有豆渣、牛粪、昆虫等杂质。2判定标准正常牛乳应为乳白色或微带黄色,具有特殊的乳香味，稍有甜味，组织状态均匀，无杂质，无凝块，无沉淀，不粘滑。三、理化分析1相对密度1.1 原理使用密度计检测试样，根据读数经查表可得相对密度的结果。1,2 仪器和设备密度计：20 /4 ，玻璃圆筒或 200 mL250 mL ，量筒：圆筒高度应大于密度计的长度，其直径大小应使在沉入密度计时其周边和圆筒内壁的距离不小于 5 mm。1.3 分析步骤取混匀并调节温度为10 25 的试样，小心倒入玻璃圆筒内，勿使其产生泡沫并测量试样温度。小心将密度计放入试样中到相当刻度30处，然后让其自然浮动，但不能与筒内壁接触。静置2min3 min，眼睛平视生乳液面的高度，读取数值。根据试样的温度和密度计读数查表1 换算成20 时的度数。14分析结果的表述（资料来源18生乳相对密度的测定.pdf）4.2酒精实验法测酸度4.2.1原理实验条件：本实验室提供的现有条件实验时间：周三至周五下午，周六上午； 4.254.28第一组；5.25.5第二组实验分组：3人/组，分组号为两位数字由课代表拟定，实验设计和实验报告均应体现本组全部人（资料来源18生乳相对密度的测定.pdf）2酒精实验法测酸度2.1原理以酚酞为指示液，用0.1000 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定100 g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经计算确定试样的酸度。2.2 试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的三级水，中性乙醇乙醚混合液：取等体积的乙醇、乙醚混合后加3 滴酚酞指示液，以氢氧化钠溶液（4g/L）滴至微红色，氢氧化钠标准溶液（NaOH）：0.1000 mol/L，酚酞指示液：称取0.5 g 酚酞溶于75 mL 体积分数为95 %的乙醇中，并加入20mL水，然后滴加氢氧化钠溶液（8.1）至微粉色，再加入水定容至100 mL。2.3 仪器和设备天平：感量为1 mg。15.2 电位滴定仪， 滴定管：分刻度为0.1 mL，水浴锅。2.4 分析步骤称取10 g（精确到0.001 g）已混匀的试样，置于 150 mL 锥形瓶中，加 20 mL 新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液（14.2）电位滴定至pH 8.3 为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0 mL 酚酞指示液（14.3），混匀后用氢氧化钠标准溶液（14.2）滴定至微红色，并在30 s 内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入公式（2）中进行计算。2.5 分析结果的表述以上资料来自（20乳和乳制品酸度的测定）四、微生物检验1 菌落总数测定1.1原理菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。1.2设备和材料 恒温培养箱：36 1 ，30 1 ；冰箱：2 5 ；恒温水浴箱：46 1 ；天平：感量为0.1 g；均质器；振荡器；无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）；无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL；无菌培养皿：直径90 mm；pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸；放大镜或/和菌落计数器。培养基及试剂 平板计数琼脂培养基；磷酸盐缓冲液；无菌生理盐水。1.3操作步骤a. 样品的稀释 以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。按上述2操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15 mL20 mL 冷却至46 的平板计数琼脂培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。b.培养 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 1 培养48 h2 h。水产品30 1 培养72 h3 h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL），凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。c.菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。选取菌落数在30 CFU300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。d.菌落总数的计算方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算： N=C/(n1+n2)d （1）式中：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。2.大肠菌群计数2.1设备与材料 同菌落种数测定培养基及试剂 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤；结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）；无菌生理盐水；无菌1 mol/L NaOH；无菌1 mol/L HCl。2.2操作步骤a.样品的稀释以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。样品匀液的pH 值应在6.57.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。b. 平板计数选取2个3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。及时将15 mL20 mL冷至46 的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养18 h24 h。c. 平板菌落数的选择选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm 或更大。d.证实试验从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管内，36 1 培养24 h48 h，观察产气情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。3.美蓝还原实验3.1原理本方法中所指牛乳卫生质量包括细菌的浓度和代谢强度以及体细胞代谢消耗一定量的所需要的时间。利用微生物及体细胞浓度愈大, 代谢愈旺盛, 单位时间内消耗氧愈多, 美蓝还原褪色时间相应变短; 反之, 美蓝褪色时间则相应变长。在一定容量的牛乳内加入定量的美蓝,上覆少量消毒的液体石蜡以隔绝外界氧,在38水浴中静置观察美蓝褪色时间的长短。 3.2试剂和材料美兰溶液的配制:称取分析纯美蓝4.9ml,在100ml定容瓶内加部分蒸馏水使之全部溶解后定容至100ml,塞上瓶盖,于冰箱中贮存备用,使用期限为14日。液体石蜡（分析纯），使用前须蒸煮30min消毒。分析天平: 感量0.1mg; 定温浴槽(内高不低于21cm); 试管: 181.8cm; 金属试管架; 吸管: 1和20ml。 玻璃器皿使用前均须进行灭菌，吸管上端须放有脱脂棉以防操作时唾液进入样品。 3.3操作方法用消毒吸管吸取每个待测乳