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第一章 气相色谱一、 气相色谱的基本原理利用试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的样品被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，因此各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。二、 气相色谱仪的组成结构及作用（简答）1、载气系统：包括气源、气体净化、气体流速控制，提供稳定流量/压力的高纯载气。2、进样系统：包括注射器和进样口（隔垫、衬管），样品被注射器注入衬管后（液体样品将瞬间汽化），被载气带入色谱柱，分流功能也在进样口实现。3、色谱柱和柱温箱：在恒温或程序升温控制下，样品中各组分在色谱柱上实现分离4、检测系统：获得与各组分含量呈比例的信号。5、记录系统：包括放大器及记录仪，或数据处理装置及工作站，记录检测器获得的信号，得到色谱图，并可以对色谱峰进行积分等处理。 色谱三温（填空）1、汽化室温度：高于沸点。2、色谱柱温度：低于沸点。提高柱温可减小气相、液相传质阻力，改善色谱柱分离效果；但又可使分子扩散加剧，影响柱效；并且温度较低，则会使分析时间延长。3、检测器温度：应选择高于色谱柱温，可避免组分在检测器端冷凝或产生其他问题。 检测器类型（填空，列举几种检测器）检测器载气测定浓度应用热导检测器（TCD）氦、氢、氩、氮50ppm 以上无机气体、有机化合物氢火焰离子化检测器（FID）氦、氮数ppm 以上有机化合物电子捕获检测器（ECD）氮数ppb 以上有机卤素等化合物火焰热离子检测器（FTD）氦、(氮)数ppb 以上氮、磷化合物火焰光度检测器（FPD）氦、氮约0.1ppm硫、磷化合物氮磷检测器（N/P）氮、磷化合物质谱检测器（MS）1、浓度型检测器：测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化，检测信号值与组分的浓度成正比。热导检测器；2、质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比。FID；3、广普型检测器：对所有物质有响应，热导检测器；4、专属型检测器：对特定物质有高灵敏响应，电子俘获检测器。几种气体装在钢瓶中的颜色：氮气-黑色；氢气-绿色；氧气-蓝色；氨气-黄色（填空） 氢火焰离子化检测器（FID）原理在外加电场作用下，氢气在空气中燃烧，形成微弱的离子流。当载气带着有机物样品进入氢火焰时，有机物与O2进行化学电离反应，所产生的正离子被外加电场的负极收集，电子被正极捕获，形成微弱的电流信号，经放大器放大，由记录仪绘出色谱峰。 质谱检测器的工作原理质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以电子轰击或其他的方式使被测物质离子化，形成各种质荷比（m/e）的离子，然后利用电磁学原理使离子按不同的质荷比分离并测量各种离子的强度，从而确定被测物质的分子量和结构。有机质谱仪主要用于有机化合物的结构鉴定，它能提供化合物的分子量、元素组成以及官能团等结构信息。分为四极杆质谱仪、离子阱质谱仪、飞行时间质谱仪和磁质谱仪等。本实验中使用的是四极杆质谱仪。（填空题） 色谱柱选择色谱柱的选择主要是选择固定液或固定相，遵循“相似相溶”原理。基于此原理的色谱流出规律如下： 分离非极性物质：一般选用非极性固定液，这时样品中的各组分按沸点次序先后流出色谱柱，沸点低的先流出，沸点高的后流出； 分离极性物质：选用极性固定液，这时样品中的各组分主要按极性顺序分离，极性小的先流出色谱柱，极性大的后流出色谱柱； 分离非极性和极性混合物：一般选用极性固定液，这时非极性组分先出峰，极性组分（或易被极化的组分）后出峰。挥发性有机酸属于极性物质，所以选择极性色谱柱DB-WAXetr，其固定相是聚乙二醇（PEG），强极性。最高使用温度240。苯系物是非极性的化合物，部分有弱极性，针对苯系物样品的测定，选择固定相为5%苯基95%二甲硅亚芳基硅氧烷的非极性柱DB-5MS，“MS”是指针对质谱检测器设计的低流失气相色谱柱。三、 气相色谱定性定量方法（掌握）1、利用纯物质保留时间定性的方法利用保留值定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。它的依据是在相同的色谱操作条件下，同一种物质应具有相同的保留值，当用已知物的保留时间与未知物组分的保留时间完全相同，则认为它们可能是相同的化合物。这个方法是以各组分的色谱峰必须分离为单独峰为前提，同时还需要有作为对照用的标准物质。利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。2、质谱图定性方法以相同的70eV能量电子轰击样品束，同一种物质应具有相同的质谱图。国际上通用的标准质谱库收集了大部分已知化合物在70eV电子轰击电离源下产生的质谱图，如NIST库。用未知物组分的质谱与质谱库中的标准图比对，按照相似度可排列出可能的化合物。如果要进一步确认，则需用标准样品进样，以保留时间辅助确定。3、色谱定量方法色谱定量分析的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。因为峰高比峰面积更容易受分析条件波动的影响，且峰高标准曲线的线性范围也较峰面积的窄，因此，通常情况是采用峰面积进行定量分析。外标法又称标准曲线法，依照测量标准品所绘制的曲线来计量被测样品的含量的方法。当样品中所有组分都得到良好的分离并都能被检测而得到色谱峰时，则可利用外标法定量计算样品中各组分的浓度。其定量的依据是被测物质的量与它在色谱图上的峰面积（或峰高）成正比。数据处理软件（工作站）可以给出包括峰高和峰面积在内的多种色谱数据。一般由被测物所配标准浓度与峰面积做标准曲线，由标准曲线求出被测物浓度。优点是不使用校正因子，准确性较高，适用于标准曲线的基体和样品的基体大致相同的情况下大批量试样的快速分析；缺点是操作条件变化对结果准确性影响较大，当样品基体复杂时不正确，对进样量的准确性控制要求较高。内标法是选择适当的物质作为内标物质，定量加入被测样品中，根据被测组分和内标物质的峰面积之比，乘以校正因子，对应内标物质加入量所进行含量测定的方法。其优点是色谱条件对结果影响不大，准确度、精度较高；缺点是选择合适的内标物质比较困难。归一法即面积归一法，是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总面积峰的比值来定量的方法。优点是简便易懂；缺点是要求检测器对所进样品全部都能响应，而且相应的校正因子应尽量相近，只能进行粗略定量，不宜用于微量杂质的检查。标准加入法是将一定量已知浓度的标准溶液加入待测样品中，测定加入前后样品的浓度。加入标准溶液后的浓度将比加入前的高，其增加的量应等于加入的标准溶液中所含的待测物质的量。如果样品中存在干扰物质，则浓度的增加值将小于或大于理论值。标准加入法可以有效克服外标法基体复杂时不准确的缺点，但速度很慢，适合样品数量少的时候用。四、 气相色谱预处理技术1、将取得的污泥发酵液，离心5000-8000转/min，取上清液过0.45um膜，稀释50-100倍，在2mL气相色谱样品瓶中，加入0.9mL稀释后样品，再加入3%磷酸0.9mL（使得pH2）。2、吹扫捕集原理：通过吹脱管用氮气将水样中的挥发性有机物VOCs连续吹脱出来，通过气流带入并吸附于捕集管中，待水样中VOCs被全部吹脱出来后，停止对水样的吹脱并迅速加热捕集管，将捕集管中的VOCs热脱附出来，进入气相色谱仪。气相色谱仪采用在线冷柱头进样，使加热脱附的VOCs冷凝浓缩，然后快速加热进样。与其他方法相比，吹扫捕集法具有样品用量少，组分损失小，检测限低，无溶剂污染，操作快捷方便等特点。吹扫捕集条件：吹脱时间8min，捕集温度35，解析温度180，解析时间6min，烘烤温度220，烘烤时间25min，吹扫气体为高纯N2，吹脱流速40mL/min。（掌握）五、 气相色谱试验步骤1. 气相色谱(FID)测定污泥发酵液中的挥发性有机酸1. 通载气N2约1分钟后，打开氢气和空气钢瓶。2. 打开稳压电源、打开气相色谱仪主电源，打开电脑及工作站。3. 分别设定柱温、进样口温度和检测器温度50、220和250。4. 当温度达到设定值后，在工作站中，设定分析文件名、文件路径和仪器方法，等待仪器显示ready。6. 将标准样品系列依次从低浓度到高浓度手动进样0.5uL，按start按钮开始进样测试。7. 将样品自动进样0.5uL，按start按钮开始进样测试。8. 测试结束后，对每个色谱图进行积分处理，并记录所有数据。9. 启动降温程序，待柱温、进样口温度和检测器温度均降至50以下后，依次关闭气10.相色谱仪、化学工作站，关掉气体钢瓶及稳压电源。2、吹扫捕集-气相色谱-质谱联用法测定污水中苯系物1在工作站中，设定分析文件名、文件路径和仪器方法，等待仪器显示ready。2将标准样品系列依次从放在吹扫捕集自动进样器的样品盘上，点start按钮开始，吹扫捕集装置将按照设定好的程序进行吹扫、捕集，脱附后样品直接注入气相色谱，自动开始色谱测定。3测试结束后，对每张色谱图的每个色谱峰进行定性分析，通过搜索标准质谱库，为每个色谱峰定性，并进行积分处理，并记录所有数据。六、 气相色谱注意事项1、检测器温度不能低于进样口温度，否则会污染检测器进样口温度应高于柱温的最高值，同时化合物在此温度下不分解。2、含酸、碱、盐、水、金属离子的化合物不能分析，要经过处理方可进行。3、进样器所取样品要避免带有气泡以保证进样重现性。4、取样前用溶剂反复洗针，再用要分析的样品至少洗2-5次以避免样品间的相互干拢。5、需直接进样品，要将注射器洗净后，将针筒抽干避免外来杂质的干拢。七、 气相色谱思考题1. 影响气相色谱分离的因素有哪些？对于不同的分析对象，只要选择合适的流动相和固定相，一般可以达到分离的目的。这也是色谱分离比其他分析法具有更高的分离能力和选择性的原因。但当分析不同类型样品时，需要换用不同的色谱柱才能实现相应的分析要求。同时，色谱三温（汽化室温、柱温和检测室温度）的优化也是十分重要的影响因素。2. 通过标准谱库的检索，分析出峰时间为5.59min、7.17min和7.79min的色谱峰代表什么物质？（掌握）氯苯 正丙苯 异丁苯3. 通过S/N分析质谱分析中，全扫描和单离子扫描的区别。（掌握）全扫描是对指定质量范围内的离子全部扫描并记录，得到的是完整的制品图，它提供未知物的相对分子质量和结构信息，可以进行库检索，灵敏度较差。选择离子扫描是对离子进行选择性检测，只记录选定的离子，不相关的干扰离子统统被排除；选定离子的检测灵敏度大大提高。但选择离子扫描值能检测有限的几个离子，不能得到完整的质谱图，因此不能用来对未知物进行定性分析。4. 吹扫捕集预处理与顶空预处理的特点和区别。（掌握）顶空色谱进样法是一种方便、快捷的色谱进样技术。其基本原理就是将待分析的样品置入一密闭容器内，在一定温度下样品中的挥发性组份经过一段时间，在两相中达到平衡，通过抽取顶部空间气体进行色谱分析。吹扫捕集通过吹脱管用惰性气体将水样中的挥发性有机物VOCs连续吹脱出来，通过气流带入并吸附于捕集管中，待水样中VOCs被全部吹脱出来后，停止对水样的吹脱并迅速加热捕集管，将捕集管中的VOCs热脱附出来，进入气相色谱仪。气相色谱仪采用在线冷柱头进样，使加热脱附的VOCs冷凝浓缩，然后快速加热进样。与其他方法相比，吹扫捕集法克服了色谱分离中溶剂主峰掩盖其他峰的问题，而且比静态顶空有更高的检测灵敏度，有富集功能，更适于痕量和超痕量分析，具有样品用量少，组分损失小，检测限低，无溶剂污染，操作快捷方便等特点。存在的问题是，所用时间较多，吹扫中有可能引入杂质以及吸附剂性能的选择等。两者区别：（1）目前的顶空主要是做易挥发性的物质，而吹扫捕集的加热温度能达到检测半挥发性物质的要求；(2)吹扫捕集相对顶空来说，灵敏度会更高，但是吹扫中有可能引入杂质，特别是容易造成样品之间的交叉污染，从而它的重现性也会受到牵连。而顶空却能杜绝吹扫的弊端；（3）吹扫捕集的的U型管道是不能经受得信酸碱的腐蚀的，比如说水中三氯乙醛的检测，加入固体氢氧化钠后，总有一天会让管道堵住或者是被腐蚀。而压力模式进样的顶空进样器却不会受到任何影响。也就是说，从灵敏度方面来说，吹扫捕集是优于顶空的；而从重现性来说，压力进样方式的顶空必定高于吹扫捕集，特别是那种带有吹扫功能的动态顶空，灵敏度还可以与吹扫捕集媲美。5. 在气相色谱分析中为了测定下面组分，宜选用哪种检测器？为什么？（1） 蔬菜中含氯农药残留量；电子捕获检测器electron capture detector, ECD高选择性检测器，仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14 g /mL， 对大多数烃类没有响应。较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。（2） 痕量苯和二甲苯的异构体；质谱检测器？FID检测器（3） 啤酒中微量硫化物。火焰光度检测器（FPD）火焰光度检测器是一种高灵敏度，仅对含硫、磷的有机物产生响应的高选择性检测器，适用于分析含硫、磷的农药及环境样品中含硫、磷的有机污染物。第二章 液相色谱一、 液相色谱的基本原理液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。分配色谱原理：主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同（分配作用）而实现分离的液相色谱分离模式。Agilent 1200 LC液相色谱仪的工作过程：输液泵将流动相（经过在线过滤器）以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，流动相将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。正相色谱法采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高中中低流动相极性低中中高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出二、 液相色谱仪的组成结构及作用1、输液系统：恒流泵和恒压泵，单元泵和多元比例泵等梯度洗脱2、进样系统：进样器、六通阀等；3、分离系统：色谱柱和梯度洗脱控制装置；4、检测系统：检测器、信号放大器装置等；5、数据处理系统：记录仪或数据采集、数据处理软硬件。 Agilent 1200 LC液相色谱仪（四元泵、自动进样器、柱温箱、 UV-VIS检测器、C18色谱柱)， 稳压电源。流动相真空在线脱气机四元比例阀主动输入阀泵头出口单向阀压力阻尼器（侧压力）泵头排液阀自动进样器（其冷凝水排水管必须高于收集瓶，不能浸在液体里。其下有一控温模块，定量环标配100ul，一般进样量5ul-50ul较好）柱温箱紫外监测器（流通池）荧光检测器（一定要荧光串联在紫外之前，因其流通池耐压20bar，紫外可耐压40bar） C18柱-反相HPLC（reversed phase HPLC）由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。 紫外-可见光（UV-VIS）检测器原理基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS 对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长。（Agilent 1200 UV-VIS检测波长范围为190nm-600nm）Lambert-Beer定律：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,与其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比. A=lg(1/T)=Kbc（掌握）A为吸光度,T为透射比,是透射光强度比上入射光强度 c为吸光物质的浓度 b为吸收层厚度。二极管阵列检测器（diode-array detector, DAD）工作原理以光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等）作为检测元件的UV-VIS检测器，它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。（Agilent 1200 DAD全扫描波长范围为190nm-950nm）。三、 液相色谱定性定量方法根据标准样品的保留时间定性；根据标准样品的的标准曲线定量（外标法）标准曲线绘制方法：（1）先打开数据file-load signal,选中一个数据文件-ok（2）Calibration-New calibration-定一个浓度值-ok（3）在compound 里输入峰名（4）多点校正，重复（1）后，在校正中添加级别，（3）完成后，保存方法四、 液相色谱试验步骤（1）准备根据待测物要求配制多个浓度点标准样品，待测样品（样品需要前处理），准备HPLC所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。（2）样品分析1）开机。打开电脑、HPLC各组件电源（所有组件）、打开软件。2）配置仪器，打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。（逆时针方向旋松泵头（2-3圈）在软件上泵模块，设置泵里控制排A（设为100%）或B，流速为3-5ml/min，排5-10min，A相排完后，直接切换到B，即将B相设为100%，确认即可依次排所需流动相各流动相均排完后将流速改回原来的1ml/min顺时针方向旋紧泵头。注意：排气时注意观察压力，如果压力超过10bar，报警，可能是滤芯脏了）3）建立平衡柱子分析方法，保存并运行。4）在脱机状态下建立样品分析方法，设置自动进样器方法（sequence），设置数据保存文件。5）待柱子平衡后，运行所设置的sequence，分析标准样品及实际样品。6）建立清洗及保存柱子的方法，并在样品分析结束后运行。7）所有程序结束后，关泵、关灯，退出程序，关闭主机、电脑及相关附件。（3）数据处理可在脱机状态下整理实验数据。五、 液相色谱思考题1、为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、流动相使用前为什么要脱气？脱气的方法？（简答）流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。脱气方法：逆时针方向旋松启动阀和废液阀，在软件上，泵流速设置为1-3mL/min并开泵，在废液阀处用注射器接出废液，1-2min后，关闭废液阀，再冲洗12分钟后，停泵，旋紧启动阀，流速设回1mL/min。（注意：不要过度拧紧废液阀和启动阀！）3、如何防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞，以及堵塞后的处理？（简答）溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液（PH=4-7）。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。A：请严格执行溶剂过滤。B：请勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液C：如果应用许可，可在溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠.D：在溶剂瓶内溶剂的上方小流量连续吹氩气,以隔绝空气。E：避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。溶剂瓶里的砂心滤头清洗方法：用浓硝酸（分析纯）泡1小时左右，再用液相用水泡1-2小时，冲洗干净即可，不建议用超声洗。4、系统压力过高的原因有哪些？压力过高，可能的原因：A色谱柱进口过滤芯被污染B冲洗阀过滤芯被污染C色谱柱被污染D连接管路的毛细管赌赛E进样器转子上的凹槽被赌赛F进样针或针座被赌赛5、新柱子活化：（一般情况）1）90%水，10%甲醇 冲洗10-20min，2）90%甲醇，10%水 稳定30min，具体根据各柱子的说明书来做，有的柱子是直接用100%的有机溶剂来活化。6、清洗及保存柱子的方法：（一般情况）1）95%水，5%甲醇，1ml/min，冲洗半小时；2）再过度到100%甲醇（半小时作用）；3）用100%甲醇冲洗1小时。（短期内使用），如果长期不用，建议90%的甲醇，10%的水保存，因为有机相易挥发，长期不用，柱子会干。如果加盐的话（峰形更漂亮），要用脱盐系统，并且清洗时，要将盐相换成水相，不能用盐洗系统。7、4个溶剂瓶里的砂心滤头清洗方法用浓硝酸（分析纯）泡1小时左右，再用液相用水泡1-2小时，冲洗干净即可，不建议用超声洗。换溶剂、过滤头后，都要排气泡。如果系统进气泡：用异丙醇，低流速赶气泡8、紫外-可见光检测器等度分析苯类化合物：实验目的、实验原理、优缺点、适用范围、实验步骤（包括前处理，实验基本操作，实验结果分析，后续处理仪器保养）？（试验设计题）选择流动相时应该注意几个问题：1） 尽量使用高纯度试剂做流动相，防治微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加；2） 避免流动相和固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子；3） 试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积；4） 流动相同时还应满足检测器的要求，流动相不应有紫外吸收；6、高效液相色谱定性、定量的依据是什么？7、高效液相色谱分析的特点及应用范围1)高压：流动相为液体，流经色谱柱时，收到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加压；2）高效：分离效能高3）高灵敏度4）应用范围广：70%以上的有机物可用高效液相色谱分析5）分析速度快、载液流速快第三章 离子色谱一、 离子色谱的基本原理离子交换分离原理：离子交换色谱是离子色谱中的一种，其分离机制主要是离子交换，是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换，依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。Dionex IC 1000 离子交换色谱仪的工作过程：泵将Miniport超纯水，以稳定的流速（或压力）输送至分析体系，在进入分析之前，先进入KOH发生器，产生的淋洗液在进入色谱柱之前通过自动进样器将样品导入，淋洗液将样品带入色谱柱，在色谱柱中各组分因对固定相的亲和力的不同而被分离，并依次随淋洗液流入抑制器，在抑制器中进行离子交换以提高检测信号，再依次进入检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。特点：1、快速、方便对7种常见阴离子（F-、Cl-、Br-、NO2-、NO3-、SO42-、PO43-）和6种常见阳离子（Li+、Na+、NH4+、K+、Mg2+、Ca2+）的平均分析时间已分别小于8min。用高效快速分离柱对上述7种最重要的常见阴离子达基线分离只需3min。 2、灵敏度高离子色谱分析的浓度范围为低gL（110gL）至数百mgL。直接进样（25L），电导检测，对常见阴离子的检出限小于10gL。 3、选择性好IC法分析无机和有机阴、阳离子的选择性可通过选择恰当的分离方式、分离监测方法来达到。与HPLC相比，IC中固定相对选择性的影响较大。 4、可同时分析多种离子化合物与光度法、原子吸收法相比，IC的主要优点是可同时检测样品中的多种成分。只需很短的时间就可得到阴、阳离子以及样品组成的全部信息。 5、分离柱的稳定性好、容量高与HPLC中所用的硅胶填料不同，IC柱填料的高pH值稳定性允许用强酸或强碱作淋洗液，有利于扩大应用范围。应用范围：本方法适用于地表水、地下水、饮用水、降水、生活污水和工业废水等水中无机阴、阳离子的测定以及其他对环境有害物质的价态分析和形态分析。二、 离子色谱仪的组成结构及作用ICS-1000离子色谱系统可以进行抑制型或非抑制型电导检测，它由淋洗液、高压泵、进样阀、保护柱/分离柱、抑制器、电导池和数据处理系统组成。1、淋洗液：ICS-1000可以进行等浓度淋洗。 2、进样阀：样品由自动进样器或人工注入定量管后切换位置，由淋洗液推入分析柱。3、分离：采用离子交换的分离方式，根据离子半径和价态的不同通过分离柱分离。4、抑制：淋洗液和样品离子从分离柱进入抑制器，淋洗液电导被抑制，背景噪音降低。5、检测：电导池检测样品离子的电导率。 6、数据分析：电导池将检测信号传输至数据收集系统，根据离子的保留时间、峰高/峰面积等参数进行定性/定量计算，得出最终结果。 离子交换色谱一般用含盐的水溶液作为流动相。选择离子交换色谱的流动相应满足以下几个条件：（1） 应能够充分溶解各种盐并提供离子交换必需的缓冲液；（2） 具有合适的离子强度以便控制样品的保留值；（3） 对被分离的对象有选择性。 抑制器ASRS-4mm工作原理（用OH-体系）（1）水进入阳极电离，产生H+，通过阳离子交换膜进入抑制器（中间通道）；（2）OH-携带Cl-、SO42-等进入抑制器，并与H+结合生成HCl，H2SO4等，以离子形式存在，进入检测器检测。（3）剩下的阳离子通过阳离子交换膜，进入并与阴极电离产生的OH-结合，废液排出。（实质是用H+代替其他阳离子进入检测器，因为H+的摩尔电导最高，所以以HCl形式进入电导检测器，能够降低背景电导，从而提高待测离子的灵敏度）。 RFIC淋洗液发生器发生原理（KOH淋洗液发生原理）淋洗液发生器由高压KOH发生室和低压K+电解槽组成。KOH发生室装有一个穿孔的铂金阴极，钾离子电解槽装有一个铂金阳极。KOH发生室通过阳离子交换膜与K+电解槽连接。离子交换连接器允许来自K+电解槽的K+通过并进入高压KOH发生室，而阻止来自K+电解槽的其他阴离子进入。离子交换连接器将高压KOH发生室与低压K+电解槽隔开，泵驱动去离子水通过KOH发生室，在正负极之间加上直流电压，水在正极和负极发生电解，在正极产生的H+代替电解质溶液中的K+，被置换出的K+跨过阳离子交换连接器进入KOH发生室，这些K+与在阴极产生的OH-结合生产KOH，即用于阴离子交换色谱的淋洗液。 抑制器ASRS-4mm工作原理（用CO32-/HCO3-体系）：用H+代替其他阳离子进入检测器，因为H+的摩尔电导率最高，所以以HCl的形式进入检测器，能够降低背景点到，从而提高待测离子的灵敏度（1）水进入阳极电离，产生H+，通过阳离子交换膜进入抑制器（中间通道）；（2）CO32-/HCO3-携带Cl-、SO42-等进入抑制器，并与H+结合生成HCl，H2SO4等，以离子形式存在，进入检测器检测。（3）剩下的阳离子通过阳离子交换膜，进入并与阴极电离产生的OH-结合，废液排出。（实质是用H+代替其他阳离子进入检测器，因为H+的摩尔电导最高，所以以HCl形式进入电导检测器，能够降低背景电导，从而提高待测离子的灵敏度）。 电导检测器电导检测器是离子色谱的通用型检测器，其检测的原理是电导，主要用于测定无机阴阳离子和部分极性有机物。电导检测器通过在外加电场作用下使待测物质发生电离，离子通过流通池引起电导率的变化来进行检测。一般而言，呈离子态的物质都可以用电导法测定，但溶液的电导率是其各种离子的加和，供离子分离用的溶剂本身的高电导率会掩盖待测介质中离子的电导，所以只有在一种离子电导率占绝对优势的情况下方可检测。三、 离子色谱定性定量方法外标法 同上四、 离子色谱样品预处理（掌握）离子色谱样品预处理的目的主要是将样品中的目标离子从样品介质中最大浓度地转移到水溶液或水与极性有机溶剂的混合溶液中，以达到减少或取出干扰物、大大降低基体浓度、调节pH、浓缩和富集待测离子成分的多重目的，使之符合进样的要求，获得准确的分析结果。 注意：含强疏水性物质不能直接进样。1、过滤：0.22um,0.45um过滤膜，除去样品颗粒物，用高纯水冲洗滤膜 ，以减少沾污。2、稀释：待测物浓度较高时，应预先稀释，一般未知样品稀释100倍，降低干扰物的浓度。分析未知样时，先测其电导率，与自来水电导率比值，为稀释倍数。3、基体消除： 去除样品中所包含的，有可能损坏仪器或者影响色谱柱/抑制器性能的成分重金属离子、有机大分子；去除样品中所包含的，有可能干扰目标离子测定的成分高离子强度基体。含强疏水性物质不能直接进样。4、样品净化（固相萃取法、膜法、阀切换技术）：OnGuard固相萃取柱，P型、RP型、Ag型、Ba型、H型、A型，IonPac NG1保护柱：去除疏水性有机组分。5、样品消解（针对有机物）：碱熔法、干式灰化法、氧瓶/氧弹燃烧法、水蒸汽蒸馏法、高温热解法、紫外光分解等。测阴离子，不能用常规的酸消解，测阳离子可以。五、 离子色谱试验步骤1、上机准备根据待测物要求配制5个浓度点标准样品，待测水样1-2个（样品需要前处理），准备IC分析所需超纯水，检查线路是否连接完好，气瓶是否有气等。2、样品分析（一）、开机打开氮气，指针压力6kPa；打开电脑（进widows 2000系统），离子色谱电源；打开Chromeleon的HU0E18F08FDDBD_localICS-1000-System-AS40.pan设计界面；赶气泡；开泵，待泵压力上升至1000psi以上后，开抑制器（界面方框（Suppressor-on）， 开淋洗液发生器电源及EGC，CRTR两个按钮；在淋洗液发生器上设定方法上需要的浓度，在软件上设定需要的抑制器电流，泵压力上升至2100psi左右，走基线（点绿色小圆点，acquisition on），待抑制器2uS，且稳定后，可进样。进样前，结束走基线（点绿色小圆点，acquisition off）；样品装好后（注意有齿一侧向着操作者），开自动进样器电源，按进样器（AS40 Automated Sampler）表面InjectionHold/Run，待左边TrayReady后，说明仪器已经准备好；点击 FileNewSequence （using Wizard）OKNextNext修改 Number of Vials（即进样数）Method Files （不用改，可在Sequence里修改淋洗液浓度、抑制器电流、做样时间）Next修改 Sequence Name（以日期开头，便于查找）FinishDone；测试水样：点击任何一个所建Sequence中的文件，按一下窗口上边第二条中 Start/Stop Batch 按钮，仪器即开始测试；查看结果：双击文件即可。（二）、关机关闭 Suppressor-on （点一下左边方框，使呈淡灰色）；关闭淋洗液发生器CRTR两个按钮及电源； 关泵 待压力降至 40psi左右，稳定，关掉窗口；打开 Chromeleon Server 按 Stop，待其断开；关闭离子色谱和电脑。3、数据处理可在脱机状态下整理实验数据；撰写实验报告要求：包括原理、简单及关键的实验步骤、所作标准曲线及样品的色谱图、根据各组分峰面积与浓度做出各组分的标准曲线，并计算所测样品中相关组分的实际含量。六、 离子色谱注意事项1.在通淋洗液 或水前一定要先进行脱气处理,防止气泡进入流路。2.在有淋洗液经过抑制器时,开电流,在关泵前,一定要先把电流关上，切记! 3.进不同样品要注意清洗进样口和注射器，不要污染针头。4.扳阀的速度要快，进完样后要迅速把阀从“进样位置”扳到“分析位置”，不可在中间停顿。5.连接色谱柱时，一定要先把流量调到0.3ml/min，不可高流量的情况下接柱子。6.色谱柱长时间不用，要至少半个月通一次淋洗液3060分钟，并用封头密封两端，色谱柱尽量不要通水，只通淋洗液。 7.仪器长时间不用，也要一周通一次水，防止流路管中水变质，堵塞管路。 8.对比较脏的样品一定要先经过预处理后进样，最好有一套砂芯过滤装置。 9.在做曲线时，不要忘记每次进不同浓度的样品，都要在“定量组分”表中修改浓度数值，不要在“定量结果”中修改。10.每天做完实验后，要对恒流泵进行后冲洗1-2次。11.如果每天都使用仪器，可以不取下色谱柱，如果长时间不用，一定要遵守注意事项中维护色谱柱和仪器的要求，以使仪器更好的运转。七、 离子色谱思考题1.简述离子交换色谱分析的特点及应用范围。离子交换色谱的分离机制是离子交换。离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上的反离子进行交换。其特点是耐酸碱，可在任何pH值下使用，易再生处理，使用寿命长，缺点是机械强度差、易溶胀、易受有机物污染。离子交换色谱主要用于不同基质中常见亲水性阴离子（F-、Cl-、SO42-、NO3-、Br-等）和常见亲水性阳离子（Li+、Na+、K+、Ca2+等）的分离测定。离子交换色谱主要用于可电离化合物的分离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的分离、蛋白质的分离，核苷酸、核苷和各种碱基的分离等。2.简述离子交换色谱“只加水”淋洗的优点。（掌握）只用水的免化学试剂离子色谱技术（Reagent Free Ion Chromatograph RFIC）是为解决科学工作者在进行色谱分析时经常遇到的淋洗液手工配置繁琐并容易引入手工误差、淋洗液放置氧化、线性梯度淋洗过程基线漂移、实验结果重复性差等问题由戴安公司首创推出的。技术的基本原理是利用水的电解：电解水在线产生淋洗液、电解水产生电导抑制所需的阴阳离子以及电解水完成捕获柱的在线再生，使得离子色谱的分析工作者只需要准备高纯水就可完成全部实验， RFIC技术进一步节省分析时间和劳力，降低了仪器的使用费用， 消除了人工配制淋洗液所带来的误差，有效地改善了分析的重现性。不同天、不同月和不同实验室、不同人的分析结果可以非常一致。分析工作者不再需要定期配制淋洗液和再生液，减少了接触化学试剂的机会。KOH（或NaOH）溶液是阴离子分析最常用的淋洗液，其优点是背景电导低，适于做梯度淋洗。3.影响离子色谱分析的主要因素流动相的酸度：离子交换树脂就是固体酸碱，对于强型而言pH影响不大，弱型则显著。样品浓度： 浓度高树脂的解离减小；影响吸附顺序及选择性 改变树脂表面结构，影响离子进入。温度：对稀溶液的交换影响不大;溶液浓度高时，温度升高，易水合的离子易吸附； 对弱碱、弱酸，温度升高，吸附速 加快，但温度太高会破坏树脂；溶剂：一般情况在水溶液中进行，可加入某些有极性机溶剂来改变选择性，但必须特别注意，这可能会使某些离子的交换无法进行。不同点：一、流动相不同：HPLC为液体流动相，GC为永久性气体作流动相（通常叫做载气）二、进样器不同：高效液相为平头进样针，气相色谱为尖头进样针三、色谱柱长不同： （1）气相色谱柱通常几米到几十米（气相色谱由于载气的相对分析量较低，分子间隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中流动速度快，因此可以增加柱长，以提高柱效）。（2）液相色谱柱通常为几十到几百毫米四、分析种类有差异：气相色谱分析的对象多为（不适绝对）：分子质量小于1000，低沸点，易挥发，热稳定性好的化合物。液相色谱：更适用于分析高沸点，难挥发，热稳定性差，分子质量较大（1000 - -2000）的液体化合物。五：样品柱前变化不同：气相色谱的样品在柱前必须变为气体（气化室汽化），而液相色谱的样品在柱前则无变化。六、所用检测器有差异：液相主要为：紫外检测器，荧光检测器、示差折光检测器.气相色谱主要为：氢火焰离子化检测器（FID）,热导检测器（TCD）,电子捕获检测器（ECD）,火焰光度检测器（FPD）,氮磷检测器（NPD）.相同点：基本原理相同。都是利用物质在流动相和固定相中的分配系数的差别，从而在两相间反复多次（1000-1000000次，甚至更多）的分配，使原来分配系数差别很小的各组分分离开来。高效液相色谱习题及参考答案一、单项选择题1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（ ）。A、分配色谱法 B、排阻色谱法C、离子交换色谱法 D、吸附色谱法2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（ ）中被分离。A、检测器 B、记录器C、色谱柱 D、进样器3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？A、0.5m B、0.45mC、0.6m D、0.55m4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？A、改变流动相的种类或柱子B、改变固定相的种类或柱长C、改变固定相的种类和流动相的种类D、改变填料的粒度和柱长5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（ ）A、甲醇/水（83/17） B、甲醇/水（57/43） C、正庚烷/异丙醇（93/7）D、乙腈/水（1.5/98.5）6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（ ）检测器不能使用梯度洗脱。A、紫外检测器 B、荧光检测器C、蒸发光散射检测器 D、示差折光检测器 7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（ ）范围内。A 、1030cm B、 2050mC 、12m D、25m8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（ ）A、组分与流动相 B、组分与固定相C、组分与流动相和固定相D、组分与组分9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（ ）的操作A、改变柱长 B、改变填料粒度C、改变流动相或固定相种类D、改变流动相的流速10. 液相色谱中通用型检测器是（ ）A、紫外吸收检测器 B、示差折光检测器C、热导池检测器 D、氢焰检测器11. 在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器A、荧光检测器 B、示差折光检测器C、电导检测器 D、吸收检测器12. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（ ）A、提高柱温 B、降低板高C、降低流动相流速 D、减小填料粒度13. 在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（ ）A、改变固定相种类 B、改变流动相流速C、改变流动相配比 D、改变流动相种类14. 不是高液相色谱仪中的检测器是（ ）A、紫外吸收检测器 B、红外检测器C、差示折光检测 D、电导检测器15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（ ）A、恒温箱 B、进样装置C、程序升温 D、梯度淋洗装置16. 在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（ ）A、贮液器 B、输液泵C、检测器 D、温控装置17. 高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用（ ）水A国标规定的一级、二级去离子水 B国标规定的三级水C不含有机物的蒸馏水 D无铅(无重金属)水18. 高效液相色谱仪与普通紫外可见分光光度计完全不同的部件是（ ）A、流通池 B、光源C、分光系统 D、检测系统19. 下列哪种是高效液相色谱仪的通用检测器A、紫外检测器 B、荧光检测器C、安培检测器 D、蒸发光散射检测器20. 高效液相色谱仪中高压输液系统不包括A、贮液器 B、高压输液泵C、过滤器 D、梯度洗脱装置E、进样器二、判断题：1. 液相色谱分析时，增大流动相流速有利于提高柱效能。2. 高效液相色谱流动相过滤效果不好，可引起色谱柱堵塞。3. 高效液相色谱分析的应用范围比气相色谱分析的大。4. 反相键合相色谱柱长期不用时必须保证柱内充满甲醇流动相。5. 高效液相色谱分析中，使用示差折光检测器时，可以进行梯度洗脱。6. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是减小填料粒度。7. 在液相色谱中