DC Bead：肝动脉化疗栓塞释药体系的体外特征.doc

DC Bead：肝动脉化疗栓塞释药体系的体外特征Andrew L. Lewis, PhD, M. Victoria Gonzalez, Andrew W. Lloyd, PhD, Brenda Hall, PhD, Yiqing Tang, PhD, Sean L. Willis, PhD, Simon W. Leppard, DPhil, Laura C. Wolfenden, Rosemary R. Palmer, and Peter W. Stratford, PhD目的：本研究的目的是展示一种可以加载化疗药物的栓塞微球(DC-Bead)的体外特征，以及药物加载的详细步骤。材料和方法：DC-Bead是一种栓塞微球产品，在肝动脉化疗栓塞（TACE）给药前通过加载蒽环类抗癌药物（如阿霉素）参与治疗。药物的加载可以采用阿霉素冻干粉或盐酸阿霉素制剂配制的溶液进行。在本项评估研究中，微球的粒径通过视频图像用光学显微镜进行测量。定量分析证明药物的加载对微球的水分含量及可压缩性有影响。将DC-Bead与造影剂和生理盐水混合，并通过适当尺寸的微导管输送，从而对载药微球的后续给药特征进行评价。使用T形装置监测药物自载药微球在体外不同洗脱介质中24小时的洗脱量。结果：DC-Bead在药液中浸泡10-120分钟（时间与微球尺寸有关），能够较易载入阿霉素并达到推荐的剂量水平，即每毫升含水载药微球含25mg阿霉素。其他的市售栓塞微球显示不能加载同样剂量的阿霉素或者其释药方式与DC Bead不同，因此不适合用于局部给药。DC-Bead理论最大载药量大约为45mg/mL。阿霉素载药量的增加导致载药微球含水量降低，并对压缩力的阻力增加。药物的加载也导致载药微球平均尺寸缩小（与微球的尺寸和药物的剂量相关）。这并不会影响载药微球对药物的输送，药物的加载剂量水平最大可达到37.5 mg/mL。载药微球尺寸为100-700m，能够通过2.7-F微导管输送，尺寸范围为700-900m时需要3-F导管。体外药物自载药微球洗脱的动力学模型表明，加载剂量为25 mg/mL时，尺寸范围为100-300m载药微球的50%药物释放时间为150小时，尺寸范围为700-900m载药微球的50%药物释放时间最大值为1,730小时（依赖于洗脱介质的离子强度）。相反，药物在不稳定的碘化油乳剂中快速分离，50%药物释放时间大约为1小时。结论：DC Bead能够加载阿霉素并且能够保证单位体积微球的载药剂量的精确。药物洗脱依赖于周围环境中的离子交换，可控并且持续，不像药物自碘化油中快速分离。药物的加载对于载药微球的处理和输送没有影响，这使得DC Bead适用于超选择性TACE。J Vasc Interv Radiol 2006；17：335-342缩略语：DC Bead=载药微球，EWC=平衡水分，HCC=肝细胞癌，PBS=磷酸盐缓冲液，PVA=多聚（乙烯醇），TACE=肝动脉化疗栓塞From the drug Delivery Division（A.L.L, B.H.,Y.T., S.L.W., S.W.L., L.C.W., R.R.P., P.W.S.）, Biocompatibles UK, Surrey; and Biomedical Materials Research Group（M.V.G., A.W.L.），School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, University of Brighton, East Sussex，United Kingdom.Received June 15, 2005; accepted October 24.Address correspondence to A.L.L，Biocompatibles UK, Ltd.，Farnham Business Park，Weydon Lane，Farnham，Surrey，GU9 BQL，UK；E-mail: AA.L.L., M.V.G.， B.H., Y.T., S.L.W., S.W.L., L.C.W., R.R.P. and P.W.S. are employed by Biocompatibles UK, Surrey, UK. None of the other authors have identified a conflict of interest.SIR，2006DOI：10.1097/01.RV1.0000195323.46152.B3335肝动脉化疗栓塞（TACE）没有标准的方法。尽管这种治疗方法的主要宗旨是将化疗药物局部灌注与选择性栓塞肿瘤的供养动脉相结合，但是各个国家和各个中心对于化疗药物（或者联合用药）、造影剂和336加载阿霉素的DC Bead用于肝动脉化疗栓塞的体外特征2006年2月 JVIR图1DC Bead加载阿霉素的过程Contour SE（Boston Scientific，Natick，MA）和Embospheres（Biosphere Medical，Rockland，MA），均为预装2 mL微球的注射器。碘化油（Lipiodol）以瓶提供。载药微球加载阿霉素的过程如图1所示。首先，药物溶液的制备为，将无菌水加入含有阿霉素粉末的瓶中（Pharmacia & Upjohn，Kalamazoo，MI）从而产生预期浓度的溶液（图1a）。把微球中上层盐溶液移出（图1b），加入阿霉素溶液（图1c，1d），放置直到溶液红色消退，载药微球变为红色（图1e）。载药时间与药物溶液浓度和载药微球的尺寸相关。将完成加载药物的微球吸入注射器中（如果进行导管递送试验则以50：50的比例加入非离子性造影剂（图1f），然后对已加载药物的微球进行进一步分析。在Perkin-Elmer Lambda分光光度计（Perkin-Elmer，Boston，MA）上483 nm处，紫外/可见光谱法测定废弃溶液中残留的未加载药物含量，据此计算药物加载程度。通过称量水合状态及栓塞材料的选择均不同。例如在美国人们喜欢联合使用顺铂、阿霉素和丝裂霉素（1），但主要依据的是组织毒性和经验而不是临床数据。一些研究组认为单独栓塞比化疗栓塞更有效（2），而很多研究组认为加入化疗药物对治疗有益。Llovet等（3）报道了一项以碘化油乳化阿霉素作为治疗药物的随机研究（Laboratoire Andre Guerbet，Aulnay-sous-Bois,France），与不能切除的肝细胞癌欧洲患者的对症治疗相比，结果显示生存受益显著（P=0.009）。Lo等人的随机研究（4）选择使用顺铂联合碘化油，随后使用明胶海绵颗粒栓塞，此研究结果同样显示，与亚洲患者的对症治疗相比生存率明显受益（P=0.006）。由于各种方法之间缺乏一致性导致对各种数据之间的比较极其困难，因此临床医生倾向于继续使用目前的微粒，而不采用新技术。DC Bead（Biocompatibles UK, Surrey，UK）是一种基于磺化基团修饰的聚乙烯醇水凝胶的栓塞微球产品（5）。该装置能够激活溶液中以盐形式结合的蒽环类抗癌药物复合物(如阿霉素盐酸盐)并且以可控且持续的方式释放。该装置已经被欧洲批准并且指明联合阿霉素治疗恶性富血管性肿瘤。进行栓塞前将药物加入载药微球，药物和微球同时输送，化疗栓塞一步完成，从而确保药物在局部持续释放。如果能够证明使用DC Bead进行的化疗栓塞与标准的TACE(使用碘化油/化疗药混合物)等效，则接受TACE的患者的治疗将大大简化。Johnson等（6）的药物代谢动力学研究显示如果阿霉素以碘化油乳剂形式或者单独通过动脉内输注给药，则阿霉素的血浆浓度是相同的。已经有一项临床试验（Precision trial）（7）在首批患者中评价了DC Bead。本研究在西班牙和香港两个中心对加载阿霉素的微球治疗不能切除的肝细胞癌的安全性进行了评价。与历史数据比较,本研究中期药代动力学数据表明使用加载了阿霉素的载药微球进行TACE 时，阿霉素血药浓度降低2-log（6,7）。本研究中报道了DC Bead加载阿霉素的方法以及药物的加载对栓塞微球其他特征的影响。 材料和方法每瓶DC Bead为2 mL水合微球磷酸钠溶液。药物加载能力与其他市售的栓塞微球比较，包括Bead Block（Biocompatibles UK）、第17卷 第2号Lewis等337在烘箱中80干燥恒重后的微球重量确定平衡水含量（即，在指定的介质中平衡时载药微球的含水量）（8）。将微球分散为单层的直径为7-10 mm的小圆盘，采用配有5 kN测压元件的Instron System（Model 4411；Instron，Norwood，MA），使用5mm2探针以5mm/min的速率测定微球的压缩模数。根据得到的应力/应变曲线测定模数，并将其定义为微球对压缩力的耐受力。采用装配有视频捕获设备和Image-Pro Plus软件的Olympus光学显微镜测定药物加载对于微球大小的影响（Media Cybernetics，Wokingham，UK）。对于100-700m大小的微球，采用2.7-F Progreat导管（Terumo，Leuven，比利时）进行导管递送试验（每种尺寸的微球和药物剂量n3），对于700-900m的微球采用3-F Radiofocus SP导管（Terumo）。盐溶液与Omnipaque 350造影剂（Amersham，Piscataway，NJ）以50：50混合后通过注射器和三通活塞混合，静置几分钟。然后使用适当的导管递送混合物，记录递送的难易程度、微球聚集或者损害以及导管堵塞的情况。采用T形装置测定阿霉素的洗脱动力学（图2），使用移液管将加载药物的微球移入T装置中的小室中，让药物扩散至循环的洗脱介质中（9）。这样的试验设计有效地模拟了载药微球在体内的情况，微球被装入容器中，药物从载药微球向外扩散是通过血栓和组织而不是一定体积液体。循环介质（水、盐溶液、或者磷酸盐缓冲液）维持37，通过 蠕动泵“T”-装置洗脱池药物扩散至洗脱介质中加载药物的微球图2测定药物洗脱的T形装置Perkin-Elmer Lambda 25UV/可见分光光度计在483 nm监控药物洗脱进入介质时阿霉素max值的增加。在一项对药物从碘油乳液洗脱的比较性研究中，2.5 mL盐溶液中25 mg阿霉素与2.5 mL碘油通过注射器混合形成不稳定的乳状液。通过移液管将此溶液加入T形装置中，测定微球的洗脱动力学 结果DC Bead对阿霉素的吸收是一个主动过程。不管使用的尺寸范围如何，微球均以极为高效（99%）的方式结合药物，药物的最大加载量大约可达45 mg/mL水合微球。高于此水平的药物加载量也是可以达到的，但是此时药物的释放呈脉冲式的快速释放，而载药量在45 mg/mL时的释放则更慢且持续时间更长（数据没有给出）。图3给出了光学显微镜下25 mg/mL阿霉素溶液与300-500m微球混合后的加载过程。1分钟时，蓝色微球很难与红色药物溶液区分（图3a）。10分钟内，大多数红色药物溶液消失，深红色载药微球清晰可见（图3b）。20分钟内，药物溶液变为灰色， 99%以上的药物和微球结合（图3c）。载药微球与阿霉素结合的速率与微球大小和药物溶液浓度相关（表1）。表2给出了不同微球浸没于25 mg阿霉素溶液后加载的程度。图4表明与造影剂（Omnipaque）和盐溶液50:50混合(该溶液通常用于TACE中输送微球)后阿霉素即刻损失的量，这代表输送不同微球时药物即刻338加载阿霉素的DC Bead用于肝动脉化疗栓塞的体外特征2006年2月 JVIR图31分钟（a）、10分钟（b）和20分钟（c）时25 mg/mL阿霉素在300-500 m微球中的加载进入循环中的相对量。此外，从图4也可以看到载药微球在200 mL磷酸缓冲液中洗脱后一段时间内阿霉素的含量。显然，只有DC Bead在数小时后仍然保持理想含量。剩余药物的释放仍和DC Bead的特性相符合。DC Bead对阿霉素的吸收效率也受盐浓度的影响：加载溶液的离子强度越高，加载的药物越少（数据没有给出）。因此，为了获得最大的药物加载量，添加药物溶液之前将大多数包装溶液从DC Bead 瓶中移出（图1b）。阿霉素的加载对微球的平均直径有影响（图5a）。对最大直径范围的微球（700-900 m）影响最显著，当加载最大剂量的药物时微球的平均直径大约降低35%。这是纯水更换为磷酸溶液时微球大小平均从820m肿胀为923m引起的，后来结合药物后平均大小收缩为536m。然而，最小尺寸的微球（100-300m）加载药物后收缩的相对较小。其大小的变化与微球中平衡水含量的降低以及压缩指数的增加相关，与未加载的微球相比，最大加载量达45mg/mL 时导致压缩力的耐受力约增加（图5b；700-900 m微球的数据）。导管递送试验显示，药物加载剂量为37.5 mg/mL时所有微球均容易递送，没有出现聚集或者导管堵塞。药物洗脱试验显示，当洗脱介质为纯水时阿霉素不从载药微球中释放。只有选择使用含有离子的洗脱介质和磷酸缓冲液时可以测出阿霉素的释放。图6给出了具有代表性的最大和最小规格的微球在25 mg/mL的洗脱情况。采用第17卷 第2号Lewis等339表1不同大小DC Bead中阿霉素的加载时间微球大小范围（m）阿霉素加载（mg/mL微球）加载99%的时间（分钟）100-3002520300-5002560500-7002590700-90025120500-700520500-7001045500-70037.5360500-700451440的水含量辅助聚合物链成形，从而具有能够在超过80%压缩时而变形的超常能力。加载药物时，水含量降低，材料的压缩模数升高（即需要更大的力来压缩微球）。然而，这对将微球通过微导管递送没有产生显著的影响。当微球达到最大加载45 mg/mL时，微球内所有磺化基团已经被药物饱和，药物加载的增加通过平衡分配至水凝胶的载水部分来达到。当微球载药浓度超过最大结合能力时，药物的洗脱出现突释效应，未结合的药物从微球快速释放出来，随后因被洗脱介质中离子取代而更缓慢、可控地释放。当洗脱介质是纯水且没有离子时，没有观察到药物的洗脱。其他的市售微球栓塞产品明显不具有与DC Bead类似的加载和释放阿霉素的能力（图4）。Contour SE的大孔性聚乙烯醇结构和明胶包被的三丙烯基栓塞微球均不能有效的结合药物。这些微球摄取差，分配到微球的药物在与造影剂混悬和递送期间很快损失，所以不适合作为阿霉素加载和持续释放的载体。Bead Block可以加载一些阿霉素，但是远不如DC Bead。这是因为Bead Blcok与DC Bead的结构相似，但是Bead Block的磺化基团含量低，所以它的结合能力也低；此外，混悬期间加载量大约损失25%，剩余的在体外很快被洗脱，所以不适用于持续释放药物至肿瘤。只有DC Bead在造影剂中混悬期间阿霉素的损失最小（大约0.2%），并在体外持续释放数天。药物/装置组合应该能够使药物递送至肿瘤部位的时间延长，同时阿霉素的全身毒性最小，并且可降低与传统TACE相关的副作用。DC Bead的体外洗脱动力Higuchi方程模拟洗脱动力学：m0 - m=kt1/2这里m0是加载于微球的药物浓度，m是时间t后载药微球中剩余的药物浓度，k是一个常数，与微球中起始药物浓度、扩散系数和药物溶解性相关。药物从微球的洗脱与这个模型拟合的非常好，对于每种微球相关系数为0.99，对于最小尺寸到最大尺寸的微球，k值范围为0.041-0.012。更为有趣的是，根据这个模型拟合可计算50%药物释放时间。显然，700-900 m的微球比100-300 m的微球释放药物的速度慢，700-900 m的微球的50%药物释放时间1,730小时，而100-300 m微球的50%药物释放时间为150小时。即便如此， 24小时后700-900 m微球的释放量只相当于加载于100-300 m微球总药物剂量的15%，证实了阿霉素为持续和控制性的释放，没有发生突释效应。将阿霉素与碘化油混合进行比较性释放试验，在同样的条件下洗脱。乳状液在水性介质中下沉，并且沉于T形室的底部。在这种条件下，不到4小时所有药物丢失。混合乳状液后即刻在光学显微镜下检查，可以看到碘化油为透明小滴，大小范围为几微米到数百微米。因不稳定的乳状液破坏和小滴融合，液滴的平均大小随时间而增加。红色阿霉素不能进入油相中，只能保留在水相中。讨论DC Bead快速地从溶液中结合阿霉素，最大加载浓度大约为45 mg/mL水合微球。由于药物溶液的红色显著消退同时微球呈现深红色，所以很容易看到药物加载的完成。通过研究离子的存在对于药物加载效率和洗脱动力学的影响可以了解药物与微球之间相互作用的机制。微球由聚乙烯醇聚合体组成，经磺化基团修饰以形成高含水量（95%）的水凝胶（5）。DC Bead带负电荷的磺化基团与盐酸阿霉素中带正电荷的质子化胺基的相互作用通过水凝胶释放的少量离子驱动的离子交换过程来实现（10）。由于离子基团周围的一些水分子被药物取代，因此也导致微球的平衡水含量下降（图5b）。微球340加载阿霉素的DC Bead用于肝动脉化疗栓塞的体外特征2006年2月 JVIR表2浸没于25 mg阿霉素溶液后不同微球的加载程度产品（1mL）大小范围（m）药物剂量（mg）药物加载（mg/mL）加载效率（%）10分钟时阿霉素在造影剂/盐溶液中的洗脱（mg）加载的原始量的损失（%）洗脱剩余药物100%的时间（h）Contour SE700-900363-Embosphere700-900256.8827.32.1932-Bead Block700-9002513.2552.63.7328大约24天到数周DC Bead700-9002524.99阿霉素加载（mg/mL微球）加载的量与造影剂混合后剩余的量洗脱2小时后剩余的量洗脱24小时后剩余的量Contour SEEmbosphereBead BlockDC Bead图4造影剂和盐溶液50：50混合后（*）和体外洗脱时25mg阿霉素在1 mL市售栓塞微球的相对加载量在对不能切除的肝细胞癌的随机研究中根据患者的胆红素水平选择采用50或75 mg/m2阿霉素。每次治疗推荐的阿霉素最大给药剂量是150 mg（13），当全身给药时根据药物诱导的心脏毒性推荐的最大终生剂量为450 mg/m2（14）。PRECISION Trial（7）中第一组患者以剂量递增的方式采用DC Bead治疗，使用500-700m的微球，阿霉素剂量为25、50、75和100 mg/m2，最大剂量为150 mg。结果表明本研究中TACE通常使用两瓶2 mL DC Bead，因此本临床安全性研究评价药物装载最大可达37.5 mg/mL，同时无剂量限制毒性的报告。手术前药物的加载很容易在药房中进行，但是要达到高剂量需要几小时以确保药物加载完全（表1）。25 mg/mL剂量更为便利，在1-1.5小时内加载完成。在欧洲正在进行几项有关使用含阿霉素25-37.5 mg/mL DC Bead治疗肝癌（包括肝细胞癌、神经内分泌瘤、乳腺癌转移和结直肠癌转移以及移植手术前）的临床注册。学模型显示，药物的释放方式也与微球的大小有关，较小的微球洗脱药物的速度比较大微球快（图6）。这是表面积驱动的效应，因为当离子需要穿透微球表面并且扩散至水凝胶基质替代磺化部分中的药物时，越小的微球面积越大，因此暴露于洗脱介质越多。不考虑表面积效应时，药物从载药微球的释放为控释且持续数天。这也在兔VX-2肿瘤模型的体内得到证实。研究采用100-300 m的45 mg/mL阿霉素载药微球进行栓塞（11）。分析结果显示第14天时肿瘤中仍然存在药物（研究的最后时间点），从而支持载药微球的持续释放。此外，本研究也支持了阿霉素可以在微球栓塞后通过坏死组织显著扩散（12）的研究结果。兔VX-2模型也显示，阿霉素载药微球栓塞后72小时时肿瘤中的药物浓度比采用碘化油栓塞的传统TACE大约高400%（11）。本研究中我们的观察结果是与从载药微球中释放相比，阿霉素在非常短的时间内从碘化油损失（图6）。通过显微镜对碘化油乳剂的分析显示，碘化油小滴迅速与水相分离，药物完全与水结合，不在油相内。虽然它支持Johnson等的药代动力学研究结果（6），但与通常的观点不一致，通常认为碘化油与药物相关且有助于携药物进入瘤床中。新的问题是DC Bead的载药能力是否有治疗意义与传统TACE手术的要求有关。Llovet等（3）第17卷 第2号Lewis等341平均直径（m）阿霉素浓度（mg/mL 微球）a.EWC（%）阿霉素浓度（mg/mL 微球）b.模数（kPa）图5阿霉素加载对于微球物理性质的影响：（a）平均微球直径和剂量的关系；（b）剂量对于平衡水含量（EWC）和压缩模数的影响阿霉素洗脱分数阿霉素从碘化油乳剂中洗脱从100-300 m载药微球洗脱从700-900 m载药微球洗脱时间（小时）图6.根据Higuchi模型对DC Bead和碘化油/阿霉素混合物的洗脱动力学和最佳拟合曲线增加载药微球的平均大小有轻微的缩小。参考文献1. Brown KT, Nevins AB, Getrajdman G1, er al. Particle embolization for hepatocellular carcinoma. J Vasc Interv Radiol 1998; 9:822-828.2. Lopez RR Jr, Pan SH, Hoffman AL., et al. Comparison of transarterial chemoembolization in patients with unresectable, diffuse vs focal hepatocellular carcinoma. Arch Surg 2002; 137:653-657.3. Llovet JM, Real MI, Montafia X, et al. Arterial embo