心肌肌钙蛋白I.doc

心肌肌钙蛋白I(cTnI)在心肌组织中表达，在胎儿、健康人或疾病状态的成人骨骼肌中不表达1，因而对心肌具有高度特异性。1987年Cummins等2首先报道，通过测定血中cTnI浓度可诊断急性心肌梗死(AMI)。由于肌钙蛋白具有组织特异性强、诊断窗口期长、测定方法快速、在血中出现早等优点，使其在AMI诊断中的作用越来越受到人们的重视，并于19941995年被美国国家食品与药品管理局(FDA)批准应用于临床AMI的诊断3。本文就cTnI 及其临床应用研究进行综述。 1 cTnI的分子结构与组织细胞分布 肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，包括三个亚单位：TnT、TnI和TnC。TnT是一种非对称性蛋白质，伴有一球形C端功能区，它有一个与原肌球蛋白结合的位点。原肌球蛋白与肌钙蛋白结合成Tm-Tn复合物，附着在肌动蛋白双股螺旋的纵沟内。TnI是一种碱性蛋白， 209个氨基酸组成。在无Ca2+和TnC的情况下，TnI是阻止肌肉收缩的亚单位，通过抑制肌动肌球蛋白ATP酶的活性，阻止肌球蛋白运动，而阻止肌肉收缩。TnI是一个延伸分子，采取反向平行与TnC形成二元复合物，在TnT和TnI之间形成卷曲螺旋，结成一刚性不对称的结构IT臂，约有80埃，它桥连原肌球蛋白锚定位点4。TnC呈亚铃形，两个球形功能区被一个长的中央螺旋体相连，TnC是钙离子受体，参予调节细丝的活化过程。Takeda等5研究了在Ca2+饱和形式下的心肌肌钙蛋白核心结构域的晶体结构，核心结构域能进一步分为结构明显区分的子域，它们由可变的接头连接，使整个分子具有高度的可变性。人cTnI有5个螺旋区域，呈伸展式构型。抗体识别相应抗原表位不依赖于蛋白质的三级结构，使cTnI氨基酸序列易被免疫系统识别，故cTnI具有较强的抗原性。在cTnI蛋白质的功能域中，抑制区是其最重要的功能区，它能在无钙离子存在的情况下，与组成细纤丝的肌动蛋白相互作用，抑制肌球蛋白的ATP酶活性。 cTnI以不同形式存在于心肌细胞中，如以游离形式存在于胞浆内cTnI只占很少部分，为可溶性6，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合以复合体形式存在。当心肌损伤时，外周血中cTnI主要以cTnI -TnC复合物形式居多(90以上)7。cTnI -cTnT复合物仅发现存在于50以下病人的血中，因此，检测的重要性远不如cTnI-cTnC复合物；其他形式的cTnI（如氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化、蛋白降解形式）较少8。因cTnI分子质量较CK-MB小，对心肌损伤较敏感，“微型心肌损伤”时cTnI 即可出现阳性结果，而此时CK-MB未增高或处于正常高限。当心肌细胞膜的完整性受破坏，cTnI先从胞浆内释放，因此，血清水平很快升高，而结合的cTnI由于相对分子质量大，从心肌细胞结构蛋白缓慢持续的释放9，10，心肌损伤后，外周血中肌钙蛋白一般在58 h出现增高，在1224 h达最高值，且高水平往往维持710dcTnI或1014 dcTnT11。肌钙蛋白在循环血中的半衰期为数小时，由肾脏排出体外。游离cTnI在循环血中的半衰期为67 min。所以，cTnI较早出现在血中，且持续时间长，这对于心肌损伤的诊断很有价值。 2 血清cTnI 测定的方法学 2.1 cTnI 检测方法 cTnI的测定始于20世纪80年代中期，多采用双抗体竞争放射免疫法和竞争性ELISA测定法。目前对cTnI的检测多采用化学发光法。用化学发光物质标记抗cTnI抗体大大提高了对cTnI测定的精确性和敏感性，但现在通用的cTnI测定方法尚无标准化，不同的方法采用不同的抗体识别位点，所以，在使用商品cTnI试剂盒时，必须明确商品试剂的特性，并使用相同的标准品进行质量控制。 鉴于cTnI作为心肌损伤诊断标志物的重要性及缺乏方法的标准化，目前有不少研究者对这些检测系统进行了比较评价。临床上常用的方法有Stratus检测法、AxSYM检测法、Access 检测法、Opus Plus检测法、RxL HM检测法等。早在1997年，美国临床病理学会对检测cTnI 的Access, Opus Plus和Stratus 三个检测系统进行比较，结果显示，三个系统检测到的cTnI 浓度有实质性差异。AxSYM检测法与Stratus检测法有显著相关性(r=0.88)，两种方法对AMI 检测的一致性为95.3。Mullen等12用分别表达有4个cTnI 片段的E.coli细菌裂解液来测试它们与Stratus、Opus Plus和Access免疫试剂盒之间的反应性，结果表明，Stratus和Opus Puls抗体识别cTnI的N末端部分，而抗Access抗体识别cTnI的C末端部分，而且，cTnI的C末端部分更易被降解，这也可能是造成这三种测定方法之间变异的主要原因之一。此后，Hafner 等13对RxL HM检测法进行评价，它是以两个特异性的单克隆抗体为基础的一步酶免疫检测法，比Stratus检测法更敏感，且能提供更好的预后信息。Liu等14研究表明，通过基因工程方法得到的两种cTnI-cTnC 单链多肽：ScTnI C 和ScTnI C 2（ScTnI C由全长的人cTnI和cTnC 组成，ScTnI C 2由人cTnI 28110片段和全长cTnC组成)，经单抗亲和层析纯化后，均可作为标准品使用。靳彩宁等15也对Access一代、Opus和immulite三种心肌肌钙蛋白I测定试剂盒进行评价，显示3种测定方法间具有良好的相关性，但不同方法所测cTnI参考值和患者血清中cTnI含量相差悬殊。抗凝对不同厂商出品的cTnI测定试剂影响程度不尽相同，另外，immulite测定的再现性比较好，Opus相对较差，Access一代试剂测定结果随着患者血样放置时间的延长，测定结果下降的幅度较大。据报道16，新一代的Access cTnI测定用抗体，特异识别cTnI分子位于残基33110之间的肽段，因而，所测cTnI值具有较好的稳定性。 2.2 cTnI检测方法的影响因素 2.2.1 抗体的氨基酸序列抗体 cTnI在患者的血清中会有不同程度的降解，而且由于其在血清中存在形式的不同其半衰期也不同，各种检测方法针对不同抗原决定簇的cTnI 抗体，其免疫反应也必然不同。 Katrukha 等17发现，将AMI的心肌坏死组织体外培养3 h后，cTnI的一级结构、二级结构和三级结构都出现了不同程度的改变。用不同的免疫学方法分析在心肌坏死组织血清中cTnI的降解情况时，发现位于氨基酸残基33110之间的片段高度稳定，能产生较长的持续信号，并分析可能是由于其与cTnC形成了复合物所致。Madsen等18分析显示，cTnI的蛋白水解片段中，具有96116个氨基酸残基的片段有较强的抵抗蛋白水解作用，在血清中与TnC形成二聚物的TnI片段是稳定的，而且可能拥有整个抑制区域。cTnI的抑制区域对cTnI-cTnC复合物的免疫活性和稳定性有重要作用。因此，建议选择能够优先识别较稳定的氨基酸序列的抗体，这助于cTnI免疫检测的标准化并有利于提高检测的特异性和敏感性。 2.2.2 选用标本抗凝剂 采用全血或血浆标本时的某些抗凝物质（如EDTA）也会对检测产生影响，EDTA螯合血标本中的钙离子可使cTnI -cTnC复合物解离，使游离cTnI单体增加，从而影响检测值，使不同方法测得的血清cTnI绝对值无法比较。肝素也可以直接与cTnI结合阻断抗原表位或改变分子构象而影响检测结果。 2.2.3 标本贮存时间和温度 存储时间的长短及存储运输温度的差异也会对检测结果产生影响。 2.2.4 干扰反应对测定产生的影响 另外，理论上存在着由于抗原-抗体反应的干扰而引起的假阳性。类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMAs)或嗜异性的抗体对商品试剂有明显的干扰，肌钙蛋白也可能受内源物质，如Hb和胆红素的阴性或阳性干扰。溶血或高胆红素血症及风湿等因素对cTnI测定也有一定的影响，有的可能会产生假阳性结果19。 本院一肌钙蛋白增高非心梗特殊病例： 男性，21 岁，未婚，活动后突发胸闷、呼吸困难、晕厥1 小时入院。 既往体健。 查体：T:37.2，Bp：70/40mmHg，血氧饱和度：82左右，双肺呼吸音粗，可及散在湿性罗音，心界不大，P104次/分，律齐，未及杂音，腹部（-），双下肢不种，病理征（-）。ECG：V3-V5导联ST段轻压低 ，考虑诊断：急性心肌梗死（下壁）？ 心源性休克？ 感染性休克？ 处理：吸氧、抗栓、调脂、补液、升压等对症治疗 。急诊CAG 术： 进一步检查治疗：冠脉未见异常，排除急性心肌梗死 术后急诊肺CT： 双肺上叶及下叶背段、后基底段大片高密度影，考虑病毒感染或特殊感染 双侧胸腔及心包积液 转呼吸科、ICU 积极抗感染、补液、纠正酸碱平衡失调、营养支持、纠正休克等治疗好转出院。 讨论：患者重症肺感染，导致心包积液，从而可致心肌细胞受损，特异性心肌酶（TNI）明显升高，但非冠脉病变（心肌梗死）所致。 思考：心肌酶增高一定心肌梗死？ 心肌肌钙蛋白在临床诊断中的应用 1 对心肌损伤的诊断 在诸多诊断AMI的临床生化指标中，CK-MB曾一度被认为是诊断“金标准”，已广泛应用多年。随着对cTnI的深入研究，无论其特异性还是敏感性，CK-MB 的地位都受到了严重挑战。cTnI被认为是目前最好的确定标志物，并已逐步取代CK-MB成为AMI的诊断“金标准”。 在各种发生心肌细胞损伤的冠状动脉疾病患者中，有些患者的临床表现可能不完全符合WHO关于AMI 诊断标准（不稳定心绞痛就是其中之一），但却伴有某些心肌损伤标志物（如cTnT等）的升高，这使得心肌细胞损伤标志物的检测成为可能。cTnT和cTnI在AMI后(36 h)血中的浓度很快升高，其表现和CK-MB(38 h)相当或稍早，但它们的特异性和灵敏度明显高于CK-MB，而且cTn具有相当长的诊断窗口期(cTnI710d，cTnT1014d)。数据表明cTn 对患有急性胸痛病人（无论有无心肌损伤）的诊断及鉴别诊断均优于CK-MB20，21。 不论是不稳定心绞痛还是无Q波的心肌梗死患者，cTnI都具有预后诊断价值。对不稳定冠状动脉疾患病人的随访发现，cTnI检测值大于0.1 mg/L病人的死亡率较cTnI小于0.1mg/L 病人的死亡率大3倍多。因此，任何急性冠状动脉疾患病人同时测得cTn增高，都应视为高危险性22，23。 2 AMI 后溶栓治疗的指示物 静脉注入溶栓药物是近年来常用的AMI治疗方法，在治疗后判断是否出现再灌注也成为临床医生最关注的问题之一。研究表明，如果肌钙蛋白的峰值提前出现，往往说明出现再灌注，早期冠状动脉再灌注的指示物CK-MB、肌红蛋白(Mgb)、cTnT和cTnI在血栓治疗成功后的早期动力学比较研究表明，四种标志物在溶栓后释放的早期动力学基本相似，但是，cTnT 和cTnI在发病90 min的冠状动脉再灌注平均指数显著大于CK-MB和Mgb24。 3 对围术期心肌梗死的诊断 冠状动脉搭桥术后心肌梗死的诊断在心脏手术中有重要作用。cTn是围术期心肌梗死的敏感和特异性标志物，能够鉴别出没有达到常规围术期心肌梗死判断标准的微小的围术期心肌损伤。 4 对心肌炎的诊断 与CK活性相比，心肌炎时，cTnT因其相对较高的血清检测值和较长的上升时间，而具有较高的检测敏感性，血清cTnT水平可作为急性心肌炎的诊断标志物10。 5 与肾衰竭的关系 缺血性心脏病是晚期肾病病人发病和死亡的主要原因之一，占总死亡率的大约40；这些缺血性心脏病患者中，大约25发展为AMI。因此，在晚期肾脏病病人的临床治疗中，心血管并发症的诊断成为至关重要的问题。在晚期肾脏病病人血清中，cTnT和cTnI的检测值存在着差异。晚期肾脏病人血清的cTnT升高的可能原因有：检测方法的交叉反应；cTnT在骨骼肌中的重表达；存在着微小心肌损伤。第二代cTnT分析法不会因为cTnT在晚期肾脏病病人骨骼肌中的重表达而产生假阳性，从而排除了分析法的交叉反应。研究认为，晚期肾脏病病人血清中cTnT的升高可能是由于存在一定程度的心肌损伤25。 6 与骨骼肌损伤的鉴别诊断 肌钙蛋白是横纹肌收缩的重要调节蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由3种亚基组成：肌钙蛋白C，肌钙蛋白I和肌钙蛋白T。运动性骨骼肌和心肌损伤后，骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基和心肌肌钙蛋白会发生特异性变化，因此相对于血浆肌酸激酶活性以及血浆肌红蛋白，肌球蛋白重链和肌酸激酶同工酶，骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基和心肌肌钙蛋白分别是反映运动性骨骼肌和心肌损伤的特异性敏感标志。由于第二代cTnT分析法已排除了分析法的交叉反应。因此，cTn可作为骨骼肌损伤病人的心肌损伤诊断时较好的标志物。 7 甲状腺功能减退病人心肌损伤的诊断 甲状腺功能减退导致胆固醇上升，使病人易患冠状动脉疾病以及AMI。同时，甲状腺功能减退病人常有抽筋、肌痛等骨骼肌损伤症状，因此，这种病人的血清CK、CK-MB水平都有不同程度增高。此时，cTn是甲状腺机能减退病人心肌损伤诊断时较好的标志物。 8 药物作用 cTn还被用于观察某些药物的药理作用与心脏关系的观察研究，了解是否改善或者加剧心肌缺血现象。 9 其他 如心脏移植后的排斥反应或急性心功能衰竭时，也常常出现cTn增高而CK-MB无异常的现象26。 10 小 结 由于cTnI对心肌梗死的敏感性及检测的高敏感性，使其在心脏疾病诊断与鉴别诊断中的作用越来越受到人们的重视，通过对cTnI的检测不仅可以提高心肌损伤的诊断而且大大提升了对患者的救治效率，并促使人们对已存在的诊断与鉴别诊断的方法学重新认识，然而，由于相关检验的标准仍然没有统一，以及检测中众多干扰因素的存在，使其在临床以及科研中的应用仍然受到一定的限制。 【参考文献】 1 Bodor GS，Porterfield D，Voss EM, et al. 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