卵巢上皮癌旁不同距离组织中survivin及MMP-2TIMP-2的表达.doc

卵巢上皮癌旁不同距离组织中survivin及MMP-2/TIMP-2的表达【摘要】目的通过对卵巢上皮癌旁不同距离组织的survivin及基质金属蛋白酶2(MMP-2)/基质金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP-2)的表达量检测，探讨获取癌旁正常卵巢组织的安全界限。方法采用RT-PCR检测20例正常卵巢组织，32例卵巢上皮癌组织及其癌旁0.5 cm、1.0 cm、1.5 cm处组织的survivin及MMP-2/TIMP-2的表达量。结果癌旁0.5 cm处的卵巢组织survivin及MMP-2/TIMP-2表达量明显高于正常组织(P0.05);癌旁0.51.0 cm处的卵巢组织survivin及MMP-2/TIMP-2的表达量明显低于卵巢癌组织(P0.05);癌旁1.01.5 cm处的卵巢组织survivin及MMP-2/TIMP-2的表达量和正常卵巢组织差异无统计学意义(P0.05);两种病理类型的卵巢上皮癌旁组织survivin及MMP-2/TIMP-2表达量差异无统计学意义(P0.05)。结论癌旁0.5 cm以内的组织可能是肿瘤隐匿转移的危险区域，癌旁1.0 cm可能是获取正常卵巢组织的最小安全距离。 【关键词】 卵巢肿瘤;基质金属蛋白酶2;survivin;基质金属蛋白酶组织抑制剂;癌旁组织【Abstract】ObjectiveTo investigate the safe margins for getting the normal ovarian tissues by evaluating the expression of survivin and matrix metalloproteinase-2(MMP-2)/ tissue inhibitors of metalloproteinase-2(TIMP-2) in the tissues within different distance adjacent to epithelial ovarian cancer (EOC).MethodsSurvivin and MMP-2/TIMP-2 were detected by RT-PCR in 20 samples from normal ovarian tissues,32 samples from EOC tissues and 32 samples from adjacent ovarian tissues which were 0.5 cm,1.0 cm and 1.5 cm away from cancer.ResultsThe expressions of survivin and MMP-2/TIMP-2 in the tissues within 0.5 cm from cancer were significantly higher than those in normal ovarian tissues (P0.05).The expression of survivin and MMP-2/TIMP-2 in the tissues between 0.5 cm to 1cm from cancer were lower than those in the EOC tissues (P0.05).No significant difference was found in survivin and MMP-2/TIMP-2 expressions between the tissues in 1-1.5 cm from cancer and normal ovarian tissues(P0.05).There were no difference in survivin and MMP-2/TIMP-2 expression between two kinds of histological types(P0.05).ConclusionsThe regions within 0.5 cm from cancer should be the dangerous lesions of occult metastasis.1.0 cm distal from cancer may be regarded as the minimum safe margins for getting normal ovarian tissues.【Key words】Ovarian neoplasms;Matrix metalloproteinase 2;survivin;Tissue inhibitor ofmatrix metalloproteinase;Tissues adjacent to cancer卵巢上皮癌患者手术或化疗可造成卵巢内分泌功能部分丧失或永久性丧失，严重影响了患者的生活质量。卵巢移植已广泛应用于其他恶性肿瘤恢复卵巢功能1-2，由于担心微量残留癌细胞再植入，卵巢上皮癌患者很少进行卵巢移植尝试，因此，如何甄别和获取安全的正常卵巢组织非常重要。survivin、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基质金属蛋白酶抑制剂2(tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2)是一组研究较多、其介导肿瘤侵袭和转移的作用比较肯定的基因3-4。由于RT-PCR检测相关基因表达是检出残留癌细胞或隐匿转移较理想的方法，本研究拟通过对卵巢上皮癌旁不同距离组织的survivin基因及MMP-2/TIMP-2表达量的检测，寻找获取正常卵巢组织的安全部位，为卵巢上皮癌患者术后卵巢移植提供初步依据。对象与方法一、研究对象标本取自2004年1月至2010年1月海南省人民医院妇科住院的卵巢上皮癌患者，共32例，年龄3065岁，平均年龄(45.710.2)岁，其中浆液性囊腺癌18例，黏液性囊腺癌14例，均为期患者，其中期13例，期19例。全部患者均行全面分期手术。选取同期因宫颈癌或乳腺癌行卵巢去势需切除卵巢的正常卵巢患者20例，年龄3266岁，平均年龄(46.110.9)岁，两组年龄无统计学差异，所有组织标本均经病理诊断证实。二、研究方法1. 标本采集：附件切除后立即取材，取材时保持标本无张力平铺状态，于裸视癌灶边界外3 mm作为起始点，用标尺向无癌灶方向每0.5 cm等长取材，最后切取癌组织;每段均制成2 mm×2 mm×2 mm 的组织液氮冻存待测。每段癌旁组织均取靠近癌灶侧的组织行常规病理活检，排除恶性肿瘤。由于选取的对象均为期患者，均能取到大小不等的正常组织。2. RT-PCR检测：取待测的冷冻组织，每份约30 mg在液氮低温下研磨成粉末状，加入指定缓冲液离心，取上清液按RNeasy Minikit说明书一步抽提总RNA(QIAGEN公司)，经Dnase消化，消除残存DNA，紫外分光计测样品的浓度和纯度，以β-actin为引物，PCR扩增检测有无DNA污染，取RNA 50 ng于1%琼脂糖凝胶电泳，紫外线检测摄像，取RNA 4 μg按试剂盒说明用Supercript (QIAGEN公司)逆转录成cDNA。半定量PCR反应体为25 ml。survivin、MMP-2及TIMP-2引物序列见表1。PCR反应条件：94 变性1 min,56 退火1 min(survivin),58 退火1 min(MMP-2),58 退火2 min(TIMP-2),72 延伸2 min，共35个循环，最后72 延伸5 min，产物经溴化乙啶染色，2%琼脂糖凝胶电泳，经Kodak Digital Science ID Image Analysis 图像分析系统检测积分光密度(integrated optical densities，IODs)，计算目的基因与内参照的IODs比值，即目的基因mRNA的相对含量，MMP-2/TIMP-2即两者相对含量的比值。三、统计学分析所有数据用均数标准差(x-s)表示，均数间比较采用t检验，应用SPSS 12.0软件进行统计学分析。P0.05为差异有统计学意义。结果1.survivin、MMP-2及TIMP-2半定量RT-PCR电泳图：见图1。2.正常卵巢、上皮癌及癌旁不同距离组织survivin及MMP-2/TIMP-2表达量：见表2。表1survivin、MMP-2及TIMP-2引物序列表2正常卵巢、卵巢上皮癌及癌旁不同距离组织的survivin及MMP-2/TIMP-2表达量3. 两种病理类型上皮癌及癌旁组织survivin及MMP-2/TIMP-2的表达量：见表3。表3两种病理类型卵巢上皮癌及癌旁组织survivin及MMP-2/TIMP-2的表达量讨论在癌灶周边组织学正常的癌旁组织中可能存在微小残留癌细胞或不稳定的潜在恶性细胞，这些细胞进一步发展可能导致肿瘤的发生。残留癌细胞或潜在恶性细胞的再植入是限制卵巢移植技术广泛用于卵巢上皮癌治疗的最主要原因。卵巢组织的获取均取自于活体组织并现场处理及冻存，因此找到最小安全切缘以便尽可能多地准确切取无癌浸润或污染的正常卵巢组织至关重要。目前尚未发现特异的方法筛选残留癌细胞，传统HE染色切片由于取材部位或切片间距不同，容易遗漏，阅片者易疲劳，免疫组化较容易观察细胞形态，有一定优势，但用于排除残留癌细胞时工作量巨大，不适合临床应用。RT-PCR通过扩增肿瘤细胞mRNA来证明瘤细胞的存在，被认为是检出残留癌细胞或隐匿转移的高度敏感和特异的方法5。Meirow等6报道检测CD30 T细胞受体及BCR-ABL基因表达分别用于霍奇金病、淋巴瘤及白血病患者的移植卵巢组织残存微小病灶的排查，说明选择相关的基因可以用来筛查残余微小癌灶。survivin基因在正常组织不表达或低表达7，而MMPs/TIMPs是介导细胞外基质降解的有代表性的基因平衡体，有别于MMPs/TIMPs家族的其他成员，MMP-2/TIMP-2在卵巢良性肿瘤组织表达较低8，细胞外基质降解是肿瘤侵袭的第一步，鉴于survivin及MMP-2/TIMP-2的这些特点，本研究将其用于卵巢上皮癌旁不同距离组织的残留癌细胞筛查，结果发现距原发灶0.5 cm、1.0 cm及1.5 cm的survivin及MMP-2/TIMP-2表达量有移行趋势，癌旁0.5 cm以内的组织接近癌组织的分子改变，而1.0 cm以外的组织接近正常卵巢组织的改变。结果提示在癌旁0.5 cm 以内的组织，虽然病理活检正常，却已经出现survivin及MMP-2/TIMP-2表达的显著改变，该处组织是隐匿转移或微侵袭的高危区，由于肿瘤中心区普遍存在缺氧或坏死，该区域还可能是研究肿瘤侵袭和转移的理想取材之处，而在癌旁1.0 cm以外组织的分子改变和正常卵巢组织无差异，可以认为癌旁1.0 cm是获取正常卵巢组织的最小安全切缘距离，为术中快速准确切取癌旁正常卵巢组织提供参考范围。本研究资料还显示癌旁不同距离组织的分子改变与卵巢的病理类型无关，这为临床上制定统一获取癌旁正常卵巢组织的范围提供了便利。在目前所采用的筛查残留癌细胞的方法中RT-PCR有一定的优势，但也存在一些缺陷，最主要的是扩增模板污染导致的假阳性结果，或因实验条件控制不佳而导致假阴性结果，同时RT-PCR不能反映肿瘤细胞的数目以及不能对肿瘤细胞进行形态观察和分析，在今后的研究同时结合免疫组化和流式细胞检测其结果可能更真实。本研究仅是提供了一个较初步的方法和结果，由于没有类似研究及相关的动物实验，该方法筛选出来的卵巢组织移植后的风险还有待进一步探讨，在实际临床应用时还有很多问题尚待解决。(本文图片见光盘)【参考文献】 1Georgescu ES， Goldberg JM， du Plessis SS，et al.Present and future fertility preservation strategies for female cancer patients.Obstet Gynecol Surv,2008,63(11)：725-732.2Rosendahl M，Andersen CY，Ernst E，et al.Ovarian function after removal of an entire ovary for cryopreservation of pieces of cortex prior to gonadotoxic treatment：a follow-up study.Hum Reprod,2008,23(11)：2475-2483.3孙艳，李勇，范立桥，等.Survivin胞质与胞核表达在原发性和转移性上皮卵巢癌中的意义.肿瘤防治研究，2008,35(6)：445-446.4Chernov AV，Sounni NE，Remacle AG，et al.Epigenetic control of the invasion-promoting MT1-MMP/MMP-2/TIMP-2 axis in cancer cells.J Biol Chem,2009,284(19)：12727-12734.5Mineo TC， Ambrogi V， Pompeo E，et al.The value of occult disease in resection margin and lymph node after extr