好氧反硝化细菌培养基配制.doc

好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 77. 5.好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4 7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 77. 5.富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。）细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl26H2O 0.5 g、CaCl27H2O 0.2 g、MgSO47H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至7.07.3，121 灭菌20 minLB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl26H2O 0.05 g、CaCl27H2O 0.02 g、MgSO47H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 灭菌20 minDM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41g、MgSO47H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 灭菌20 min采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 下培养23 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。接种初筛菌株至LB 培养基，在30 、160 r/min 条件下进行液体培养24 h 后，以10%的接种量接种到反硝化培养基(DM 培养基)中，30 、160 r/min 条件下进行摇瓶发酵，间隔一定时间取样。测定发酵液中硝基氮浓度(NO-3-N)和亚硝基氮浓度(NO-2-N)，通过分析其NO3-N 和TIN(NO-N+NO-2 -N)去除率，考察所筛菌株的反硝化性能。NO-3 -N：用紫外分光光度法测定；NO-2 -N：用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定4。菌体量：光密度法，用721 型分光光度计在600 nm 处测定吸光度值。微量元素溶液:EDTA(乙二胺四乙酸) 50.0 g ,ZnSO4 2.2 g , CaCl2 5.5 g , MnCl24H2O 5.06 g , FeSO47H2O