回流法提取枸杞中抗氧化成分的分析毕业论文.doc

学号：本科毕业论文（设计）学 院 专 业 年 级 姓 名 论文（设计）题目 回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究 指导教师 职称 2012年5月5日信阳师范学院本科学生毕业论文（设计）开题报告姓 名性别学 号专 业年 级郑凌云题目回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究选题意义及主要内容枸杞属于常用的补益类中药,具有补肾养肝、益精明目、清热凉血等功效。同时，枸杞在调节免疫、降低血脂和血糖、延缓衰老、抗遗传损伤等方面都具有重要的作用,因而在药材、食品等领域被普遍使用。目前已采用回流法测定其中的抗氧化成分，因而本实验欲采用不同浓度乙醇采用回流提取法，以选取回流法的最佳提取条件。思路及方法分别用蒸馏水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇回流提取枸杞中抗氧化成分，并且通过测定吸光度分析对羟自由基的清除率，以此为指标比较各种提取法的效果。指导教师意见 通过查阅相关资料，对抗氧化剂的作用和应用有一定的了解，初步拟定出枸杞抗氧化成分的研究方案，思路清晰，研究方法、内容和步骤科学合理，测试方法合适，同意开始并进入下一步实验阶段。 指导教师签名： 2012 年 3 月 8 日学院意见 学院领导签名： 2012 年 3月 11 日信阳师范学院本科学生毕业论文（设计）中期检查表学院： 专业： 年级: 题 目回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究学 号姓名指导教师职称计划完成时间：2012年5月5日论文（设计）的进度计划：1、2012年3月6日以前查阅有关资料及文献，并写出可行的实验方案。2、2012年3月22日以前写出论文开题报告。3、2012年3月23日2012年5月9日做实验，撰写论文初稿。4、2012年5月10日2012年5月19日完成论文初稿，请导师审阅。5、2012年5月19日2012年5月24日定稿及论文答辩。已经完成的内容：1.已较全面的收集了有关枸杞中抗氧化成分及测其含量的相关文献资料，并对所收集的文献，进行了分析，推敲和梳理，撰写了开题报告。2.通过对利用最佳反应条件的探索，得到了该制备实验的最佳优化条件的步骤。指导教师意见：该生态度认真，通过查阅相关资料，开题设计了枸杞抗氧化活性成分对羟自由基清除率的研究方案，前期材料准备较为充分，研究方法，内容和步骤科学合理，同意开始并进入下一步实验阶段。 指导教师签名： 2012年4月6日 备注：目 录 摘 要1关键词1Abstract1Keywords 1引言 11实验部分31.1实验材料31.2实验试剂31.3实验仪器32试验方法32.1实验原理32.2实验过程42.3实验结果53结果与讨论5参考文献 5回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究摘 要：枸杞中含有一定量的抗氧化成分，本实验采用不同浓度的乙醇作溶剂对其回流提取，并计算提取液对自由基的清除率，以选取能得到最佳提取效果的回流方法。通过实验，本论文得出结论采用百分之六十的乙醇做溶剂进行回流能得出较好的提取效果。关键词：枸杞；抗氧化；回流Abstract: Lycium contains a certain amount of antioxidant ingredients, this experiment using different concentrations of ethanol as solvent reflux extraction and calculation of the extract on free radical scavenging rate can get to select the best extraction effect returning. Through the experiment, the paper concluded that 60% ethanol solvent reflux can come up with a better extraction efficiency.Keywords: Lycium；Antioxidant；Refluxing引言生物体内过量的氧自由基会造成生物膜损伤、蛋白质变性、酶失活及DNA复制出现错误等，从而引发生物体内各种疾病的产生。有资料表明，心脑血管疾病、癌症以及艾滋病等许多疾病与氧自由基参与的反应有关，因而由氧自由基所参与的氧化反应引起的不良影响已经引起高度重视1-2。抗氧化性物质的使用可有效抑制生物体内的过氧自由基，阻断由过氧自由基参与各种氧化反应引起的一系列不良反应。目前，尽管许多人工合成的抗氧化性物质如2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)及叔丁基对苯酚(TBHQ)可以抑制氧自由基反应的发生，但随着绿色化工业的兴起及对其安全性和潜在的毒副作用等方面的考虑，合成抗氧化剂的使用越来越多的受到限制，因而从天然植物中探索或寻找高安全性的天然抗氧化物质近年已引起许多学者的关注3-6。枸杞（Lycium chinense）是一种重要的药用植物，其果实又称枸杞子。枸杞的水提取物中含有大量甜菜碱、酸浆红色素以及胡萝卜素、硫胺、核黄素烟酸和抗坏血酸等生物活性物质7。枸杞子味甘、性平，归肝、肾经，具滋补肝肾、益精明目、延缓衰老等功效8。枸杞的传统功效包括补肾生精、养肝、明目安神。因为肾脏、生殖系统、肝脏和视网膜都可以受到枸杞抗氧化作用的保护。在这些器官、系统中，肝脏得到的抗氧化保护相对来说是了解的比较详细的。枸杞的多种提取物和成分对肝脏或肝细胞都可以起到有效地抗氧化作用。除了正常情况下的肝细胞，枸杞对多种不良因素对肝脏的损害也可以起到保护作用，其中包括酒精、四氯化碳中毒和缺血再灌注。枸杞多种有效成分对视网膜的抗氧化保护也得到了多个实验室工作的验证。这些工作涵盖多种胁迫条件对视网膜损害的保护，其中包括高还原胁迫（细胞处于过度还原状态，与氧化胁迫相反）、缺血-再灌注、糖尿病造成的视网膜病变和衰老造成的视力下降。除了视网膜（属于中枢神经系统），枸杞对神经系统的其他部分也有抗氧化保护的效果，比如枸杞的牛奶制备物就可以有效保护由于产前压力对实验动物后代认知能力发育的损害。关于枸杞对生殖系统的抗氧化保护，现有的数据显示雄性和雌性生殖系统和细胞都可以得到枸杞多糖的有效保护。对于肾脏，枸杞多糖可以通过抗氧化防止糖尿病造成的肾功能障碍。此外，枸杞多糖和提取物对肌肉、胰腺、心脏和皮肤细胞都可以起到抗氧化的效果。与上述枸杞对体内多种器官和细胞类型的抗氧化保护相吻合，枸杞可以起到恢复整体正常氧化还原状态的作用。迄今为止的大多数研究是在整体（或多器官）水平上进行的。其中有项研究是针对因衰老而造成的体内多器官的抗氧化能力降低而进行的，这项研究发现枸杞多糖的使用可以使其恢复正常。此项研究还发现，枸杞多糖的抗氧化能力可与维生素C相比，并且二者结合可进一步增强抗氧化活性。在我国西北、华北各地所产枸杞中，以宁夏枸杞品质最佳9。枸杞中的药用成分多样，主要有多糖（包括蛋白聚糖）、糖脂、类黄酮、类胡萝卜素、生物碱、微量元素、多种维生素等10。现代研究已经证实了枸杞的这些传统功效，同时也发现它有降低血糖含量、抗脂肪肝、防止动脉硬化、抗癌、增强机体免疫力、防止老年痴呆症等作用10-11。与这些传统和现代功能有密切关系的，或者说贯穿这些多种功能的，是枸杞的抗氧化功能，因为由活性氧导致的氧化胁迫和氧化损伤是造成人体多种器官疾病和机体衰老的一个重要原因12-13。枸杞子作为我国名贵的中药材，具有很高的保健价值。枸杞多糖是枸杞中的主要生物活性成分，其组分之一LBP-4具有抑制人肝癌细胞增殖的作用14。枸杞多糖的提取一直是研究的热点，使用最多的方法是水循环提取，虽然近年来也出现了超声波15-17、微波18等技术辅助提取的报道，但仅限于得率方面的研究。微波提取最大特点是速度快、节省溶剂、节省时间等，有利于避免长时间高温引起的热不稳定物质的分解破坏，特别适合用于天然物质活性成分的提取19。已有不少人尝试采用沸水浴法，回流法，微波法以及超声波法提取枸杞中的抗氧化成分，但采用不同浓度乙醇做溶剂回流提取枸杞中抗氧化成分还很少有人涉足，因此，本文分别采用蒸馏水及30%，60%，95%的乙醇做溶剂提取枸杞中的抗氧化成分，并从中选取最佳回流条件。1实验部分1.1实验材料称取200g半干的宁夏枸杞置于干燥箱中，温度调至80，干燥2h。然后将其在粉碎机中粉碎，过筛40目，将所得产品装进塑料袋，密封好防止吸潮，待用。1.2实验试剂水杨酸（上海五联化工厂）；硫酸亚铁（天津市凯通化学试剂有限公司）；30%过氧化氢（天津市永大化学试剂开发中心）；95乙醇（天津市凯通化学试剂有限公司）；以上所有试剂均为分析纯。1.3实验仪器FAIJA系列电子天平（上海上平仪器公司）；HH-Z数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；VIS-7220型分光光度计（北京第二光学仪器厂）；SHZ-D（）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；名秀光波GB023CTL-K3（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）；KQ-100E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；DHG-9073B5-电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）。2实验方法2.1实验原理据齐宗韶等报道，枸杞含有丰富的抗氧化成分，100g枸杞干果含胡萝卜素8.9mg、VE12.4mg、VC73.2mg，黄酮类化合物500mg左右、这些成分均具有明显的氧化活性。除此以外，宁夏枸杞可能还含有未知的抗氧化成分，有待于进一步研究。综上所述，我们认为宁夏枸杞的抗氧化活性是多种已知和未知的抗氧化成分综合作用的结果20。为了探索枸杞的抗氧化功能，有些研究（尤其是较早期的研究）使用的是枸杞的总提取物。但大多数研究是针对枸杞中的某种特定化学成分进行的抗氧化分析。与后者相比，前者使用总提取物的研究比较粗放一些，但是这也是探索枸杞抗氧化功能不可或缺的一步，也为后者进行较为详细的研究奠定了基础。在这些使用总提取物的实验中，水溶液提取是比较常用的一种提取手段，包括以牛奶为基底的制备物，也有使用乙醇提取的。虽然提取的方法不同，但这些提取物均具备抗氧化的功能。枸杞中多种化学成分都有抗氧化的效果。其中枸杞多糖（包括糖偶联物和多聚糖）是研究的最多、最充分的一种，并且它在全身多个器官中都具有抗氧化的活性。有的研究甚至对某些特定多糖的抗氧化活性也进行了探索，比如枸杞多糖-4。多糖作为一种对抗氧化胁迫的有效成分，在其他物种中也有过报道。不过在植物多糖抗氧化方面，枸杞多糖应该是研究的比较多的一种。总黄酮是枸杞中另一类主要的抗氧化活性成分，它可以有效地清除超氧离子和氢氧自由基，降低脂类分子过氧化。这和一些报道中有关其他生物黄酮化合物的抗氧化活性也是一致的。自由基是含有未配对电子的物质21，人们发现很多疾病都与自由基有密切的关系22-23。随着自由基引起人们的关注，从天然植物中提取抗氧化成分来清除自由基成为研究的热点。二苯代苦味酰肼自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，含有单电子，被广泛用于抗氧化剂活性的研究。DPPH在515nm有强吸收，其乙醇水溶液呈深紫色，加入受试物后，溶液颜色变浅，吸光值变小，而吸光值变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系，这就是分光光度法定量分析抗氧化剂清除DPPH的依据。2.2实验过程2.2.1沸水浴法称取2g枸杞粉末,将其倒入装有100ml水的250ml烧杯中，放入100恒温水浴锅中提取后1.5h后抽虑，将滤渣再溶入50ml水中再次提取后抽率，合并滤液。2.2.2回流法称取2g枸杞粉末,将其倒入250ml烧瓶中，然后装入100ml相应的溶剂在酒精灯加热下提取1.5h后抽虑，将滤渣再溶入50ml溶剂中再次提取后抽率，合并滤液。2.2.3羟自由基清除体系在试管中依次加入1.0m的l9mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1.0ml的提取液，1.0mlFe2+溶液，1.0ml蒸馏水，最后加入1.0ml的30过氧化氢启动Feton反应，37反应0.5h，在510nm处测定吸光度A1；取1.0ml的蒸馏水代替30过氧化氢测得的吸光度为A2；取1.0ml蒸馏水代替提取液所测得的吸光度为A3。清除率越大，表示该样品的抗氧化活性越强。自由基的清除率P的计算为：清除率P1-( A1- A2) / A3100%式中：A1为样品的吸光度值 A2为对照体系的吸光度值 A3为空白组的吸光度值2.3实验结果选用30，60，95的乙醇做溶剂用回流法测定枸杞中抗氧化成分对羟基自由基的清除率，数据列于表2。表2 回流法测得不同浓度的乙醇做溶剂的羟基自由基的清除率A1A2A3清除率(P%)水0.4540.0380.61732.5830%0.4250.0500.61739.2260%0.3840.0770.61750.2495%0.5250.0550.61723.82由表2可知,用60%的乙醇做溶剂能得到最佳提取效果。3.结果与讨论由清除率可知，用水和95的乙醇作溶剂提取枸杞中的抗氧化成分效果一般，而用60的乙醇做溶剂清除率为50.24，提取效果较好。参考文献:1 靳利娥, 谢鲜梅,常丽萍.枸杞中抗氧化性物质的提取及抗氧化性研J.林产化学与工业, 2006, 26(3): 63-67.2 YU Liang-li Free radical scavenging properties of conjugated linoleic acidsJ. 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级论文题目回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究评阅人评语郑凌云认真查阅文献资料，对枸杞中抗氧化成分含量测定的研究有一定的认识，具备较好的综合能力。该论文选题新颖，实验工作量充实，研究工作具有一定的学术水平和创新性。毕业论文格式规范，论证合理，数据充分，对研究课题阐述清晰。顺利完成了本科学位论文工作,已达到学士学位论文的要求,建议本科毕业论文成绩为:良好。评 价 项 目得分毕业论文（设计）书写规范分（计15分）格式规范，符合学校规定的毕业论文（设计）撰写格式要求。毕业论文（设计）文字表达基本要求分（计15分）语句通顺、流畅；标点符号、语法正确；叙述简明扼要；思路层次清晰，概括全面准确；重点突出毕业论文（设计）正文或设计图面质量分（计55分）对于研究课题能熟练运用本专业所必须的基础理论和基本专业知识，分析问题，解决问题；理论、公式正确；概念清楚，应用合理；层次清晰；逻辑性强；论证严密，计算准确全面；图表质量好。毕业论文（设计）创造性分（计15分）研究成果具有一定水平，得出创造性结论，在某些领域获得初步进展。同行阅读毕业论文（设计）后能感到作者的研究工作具有一定的学术和实用价值，体现出很好水平 合 计 得 分评议人签名： 2012年5月6日信阳师范学院本科毕业论文（设计）答辩记录表1、简述抗氧化原理。总体来讲，氧化和络合是抗氧化的两个主要因素，这两个因素发挥抗氧化作用的途径归纳起来有如下四个方面：（1）清除自由基；（2）螯合金属离子；（3）清除氧；（4）作用于与自由基有关的酶。2、抗氧化剂的分类有哪些呢？（1）自由基吸收剂：如酚类抗氧化剂，维生素 E，类胡萝卜素。（2）氧清除剂：如类胡萝卜素及其衍生物、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈、抗异坏血酸和异抗坏血酸等。（3）金属离子螯合剂：枸橼酸、EDTA和磷酸衍生物。 3、为何进行抗氧化成分的研究？抗氧化剂是一种具有抗氧能力和能清除自由基的物质。科学证明，适量补充一些抗氧化剂，可维持免疫系统的正常运转，加强人体抵御自由基侵害的能力，延缓衰老。此外可以防止食品在贮藏，运输等过程中发生氧化变质，特别是油脂及富油脂的酸败。目前所用的抗氧化剂多为合成抗氧化剂，但已证明一些合成抗氧化剂有副作用，对人体有害，因此，找到安全可靠的天然抗氧化剂的提取方法具有一定的意义。答辩主持人宋力答辩记录人刘雪答辩时间：2012年5月15日信阳师范学院本科毕业论文（设计）成绩评审表姓 名性别专 业班 级论文题目回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究答辩评审意见该论文研究了枸杞中抗氧化成分的含量，使用回流法提取枸杞中抗氧化成分,并用自由基清除率测其含量。论文研究工作量充实，结果具有一定的学术价值，论文写作规范，条理清晰，论述合理。郑凌云同学在论文答辩过程中表述准确、论述合理，问题回答准确，对论文研究工作阐述清晰。建议本科毕业论文成绩为:良好。答辩小组组长签名： 2012年5月15日 评 价 项 目评 价 内 容报告内容（30分）1、论述思路清晰，评议表达准确；2、概念清楚，论点正确；3、实验方法科学，分析归纳合理；4、结论严谨；5、结果有一定应用价值。答辩情况（40）1、问题回答理论依据准确；2、基本概念、基础知识掌握扎实；3、语言表达清晰、流畅；4、对研究涉及的知识掌握透彻。5、重点内容研究深入、表达具有逻辑性。成果（含作品展示）（20分）论文写作规范，对前人工作有改进或突破，或有独特见解，有一定创新性结果。论文工作量（10分）理论知识、基本技能掌握扎实，能够按照毕业论文（设计）工作条例所规定的各项要求全面完成毕业论文（设计）工作。答辩小组成员姓 名性别职 称工作单位评 分合 计 得 分（总分人数）最后成绩（指导教师成绩30%+评阅教师成绩30%+答辩小组成绩40%）论文等级 良好学院领导签名： 2012年5月21日 信阳师范学院本科毕业论文（设计）指导教师指导记录论文（设计）题目： 回流法提取枸杞中抗氧化成分的研究 系 专业 2008 级阶段时间地点教师指导情况13月3日3月6日H-512对选题进行综述，介绍课题的研究意义并指导学生如何查阅中外文献资料。23月7日3月22日H-512检查学生搜集，筛选，整理的有关文献资料，指导学生完成开题报告。33月23日4月2日H-512审阅开题报告，对文献进行检查，理清基本思路，给出合成方法及测定方法，进一步完善确定最终试验方案。44月3日4月24 日H-510寻求合适的配比，反映温度等反应条件，选择合适的提取方法，进入实验。54月25日5月9日H-510查看实验进展及数据记录，指导并规范实验操作，进行中期检查。65月10日5月19 日H-512检查论文初稿，指导修改论文中的错误之处，进行改正。75月20日5月24 日H-512检查指导学生规范论文格式，定稿；提醒学生注意引用文献的代表性，可靠性和科学性进行论文答辩。指导教师（签名） 学生（签名） 袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈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