发酵题.doc

1.计算题有一题，是第四元的。2.第6、7、8、10、15会考简答题，前几章每章考一个大题，第15章考两个大题，总共就五六个简答题。3.第9、11、12、13、14章，每章会考个两分的题。4.第一章的发酵工业的范围，发酵生产工艺流程会考，第二章发酵工业菌种概述，菌种的分离帅选，菌种鉴定的方法，菌种改良的方法，工程育种，代谢工程育种会考，第八章的8.4、8.7多看看，第16章得生物炼制技术多看看，动物细胞培养多了解。5.题型：填空题20分 选择题20分 判断题20分 简答题30分 计算题10分 主要考每章的重点，但填空题，判断题应该是很细的，要注意细节，简答题不要答太多，以免影响答题速度。 上游技术：优良种株的选育和保藏（包括菌种筛选、改造，菌种代谢路径改造等）；中游技术：发酵过程控制，主要包括发酵条件的调控，无菌环境的控制，过程分析和控制等；下游技术：分离和纯化产品。包括固液分离技术、细胞破壁技术、产物纯化技术，以及产品检验和包装技术等。一、名词解释(103=30分)。纯种分离 湿热灭菌法 补料分批培养法 糖化 非牛顿流体 对数残留定律临界溶氧浓度 通用式发酵罐 Monod方程1发酵工程：是发酵原理与工程学的结合，是研究由生物细胞参与的工艺过程的原理和科学，是研究利用生物材料生产有用物质，服务于人类的一门综合性科学技术。2营养缺陷型：对某些必需营养物质(如氨基酸)或生长因子的合成能力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基(如由葡萄糖和无机盐组成的培养基)中补加相应的营养成分才能正常生长。3淀粉水解糖：淀粉水解为葡萄糖的过程成为淀粉的糖化，所制得的糖液成为淀粉水解糖，所含成分主要是葡萄糖，还有数量不等的少量麦芽糖等复合二糖、低聚糖。4冷冻干燥：亦称升华干燥，它是将湿物料在较低温度下冻结成固态，然后将其放置于高度真空下料内水分不经液态直接升华成气态，物料脱水为成品。5截留率：是指对一定相对分子质量的物质，膜能截留的程度。定义为=1- 6下游技术：是对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制为目的成分，最终使其成为产品的技术。7细胞破碎率：指细胞破碎的程度或单位细胞释放出的内含物。8固定化酶：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可回收重复利用。9BOD ：是五日生物耗氧量Biology Oxygen Demmand。指的是水中的微生物可以降解的有机物被降解后消耗的氧的量。但是生物完全降解有机物所需时间较长。为了规范和提高检测效率，国家规定以5日生物需氧量为说明水质的标准，也就是说用生物降解水中有机物5天所消耗的氧的总量。10清洁生产：是指将综合预防的环境策略持续的应用于生产过程和产品中，以便减少对人类和环境的风险性。二、简答题（65=30分）1工业用微生物的要求有哪些？2简述培养基的配制原则和应注意的问题。3双酶法水解淀粉制糖的工艺。4请列出空气灭菌的方法。5基质浓度对发酵有何影响6生产中为什么要控制pH?怎么调节和控制pH？7工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退？1）基因突变；2）变异菌株性状分离；3）连续传代；4）其他因素，如温度、湿度等8请列出空气除菌的方法。热灭菌法、辐射灭菌、静电除菌、介质过滤除菌法9简述影响氧传递速率的主要因素.氧传递速率方程：OTR=KLa（C*-CL）。凡是影响氧传递推动力（C*-CL）、气液比表面积a和氧传递常数的因素都会影响氧传递速率。（1）、溶液性质影响氧溶解度，从而影响（C*-CL）。1）氧在水中，溶解度随温度的升高而降低。2）氧在酸中，溶解度与酸的种类和浓度有关。3）氧在电解质溶液中发生盐析作用，氧的溶解度降低。4）若是几种电解质的混合液，氧溶解度根据溶液离子强度计算。5）非电解质溶液中，氧的溶解度一般随溶质浓度的增加而下降。（2）、a对氧溶解度的影响。氧的传递速率随a成正比。（3）、影响氧传递系数的因素：搅拌、空气线速度、空气分布管、发酵液性质、表面活性剂、离子强度、菌体浓度。10简述分批发酵动力学方程Monod方程及意义。（1）Monod方程 =。（2）Ks的意义为当比生长速率为最大比生长速率的一半时，限制性营养物质的浓度，它的大小表示了微生物对营养物质的吸收和亲和力大小。Ks越大，表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小；反之越大。11请列出发酵放大的方法.（1）、经验放大：1）几何相似放大；2）以单位体积液体中搅拌功率相同放大；3）以单位体积培养液的通气搅拌功率相等的原则放大；4）空气量的放大。（2）、其他放大方法：因次分析法、数学模拟法。12发酵工业中控制的主要参数有哪些？如何控制？（1）、主要参数：溶解氧、pH、呼吸商、尾气中CO2分压、代谢物浓度、氮源、碳源等。（2）、同一微生物在培养过程中，根据不同时期通过相关的手段进行控制。如CO2随其对发酵的影响而定。当其对产物合成有抑制作用时，则设法降低其浓度；若有促进作用就提高其浓度。三、问答题（48=32分）1解释代谢控制发酵及其产品的获得。2泡沫的实质和形成原因是什么？对发酵生产有何影响？3请说明噬菌体污染的途径和危害及防治噬菌体污染的措施。4请论述固定化酶和固定化细胞制备的方法与特点。5说明丙酮-丁醇发酵、己酸发酵和甲烷发酵的机理及应用。（1）、甲烷发酵的激励是厌氧菌将糖类、脂肪、蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和二氧化碳。它是由许多厌氧细菌同时进行的产酸和产气的复合发酵。（2）、己酸发酵，己酸的形成属于合成发酵，在发酵过程中，乙醇和乙酸结合生成丁酸，丁酸再与乙醇结合生成己酸。己酸可以与乙醇酯化为浓香型大曲酒的主体香气成分己酸乙酯，如浓香型的五粮液、清香型汾酒等。（3）、丙酮-丁醇发酵：丙酮丁酸菌除具有丁酸菌的通性以外，还具有能发酵产生丙酮、丁醇等中性产品的能力。在中性培养基中发酵时，一般丁酸菌和丙酮菌均能产生丁酸和醋酸，当培养基的酸度增加到一定数值后，一般丁酸菌停止发酵，并且菌体的繁殖也停止，但是丙酮丁醇菌则不然，当培养基的强度达到最高点后，由于有脱羧能力，酸度反而下降，并且产生中性的产品丙酮、丁醇、乙醇等。6发酵动力学如何分类?各自优缺点？根据微生物发酵培养方法，分分批发酵动力学，连续发酵动力学和补料分批发酵。分批发酵动力学，优点：操作简单、投资少;运行周期短;染菌机会减少;生产过程、产品质量较易控制;缺点：不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象;对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大）;养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产;非生产时间长，生产率较低。连续发酵动力学，添加新鲜培养基，克服养分不足所导致的发酵过程过早结束，延长对数生长期，增加生物量等；在长时间发酵中，菌种易于发生变异，并容易染上杂菌；如果操作不当，新加入的培养基与原有培养基不易完全混合。补料分批发酵，可以解除底物的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。7尾气分析包括哪些内容?尾气分析包括CO2对菌体生长和产物形成的影响 呼吸商与发酵的关系 CO2浓度的测定与控制。8动植物细胞培养方法与微生物培养方法有何异同。由于各种生物细胞结构，对营养要求，对环境要求和生长特性上的差异，所以培养方法上有差别。动物细胞无细胞壁，对剪切极为敏感，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提出特殊的要求。对流体耐受性比微生物低。可悬浮培养，常聚集成团。微生物则相对营养要求简单，生长较快，对环境耐受范围大，对剪切敏感性低。一般悬浮培养。四、计算题（8分）某制药厂现有一发酵罐，内装80吨发酵培养基，在121温度下进行实罐灭菌。如果每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢数位2107个，121灭菌速度常数为0.0287s-1。请问灭菌失败概率为0.001时所需的灭菌时间是多少？答：(假设发酵培养基密度同水密度)根据t= =2.303 =2.303/0.0287=678.9sec=11.3minN0=801062107=1.61015Nt=0.001K=0.0287ln1.6=0.47发酵工程设备考试题目1 工业发酵生产卡那霉素，到发酵液中产品分离提取，需要各种设备。请列出从菌种开始一直到终产品需要的主要设备名称。包括培养基和空气灭菌系统，发酵罐，以及产品分离纯化。2 试比较微生物、动物和植物灭菌设备和生物反应器。3 设计发酵罐时，应包含哪些部件以及主要设计参数。4 列出GMP对发酵类原料药生产系统的要求。5 谈谈你对本教材印象，你学到了什么？有何建议？分批发酵的优缺点v 优点： 操作简单、投资少 运行周期短 染菌机会减少 生产过程、产品质量较易控制v 缺点： 不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应及二次生长现象。 对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大） 养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产 非生产时间长，生产率较低 连续发酵动力学优缺点 添加新鲜培养基，克服养分不足所导致的发酵过程过早结束，延长对数生长期，增加生物量等； 在长时间发酵中，菌种易于发生变异，并容易染上杂菌； 如果操作不当，新加入的培养基与原有培养基不易完全混合。补料分批发酵优点 可以解除底物的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。 避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。 菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。 与连续发酵相比，补料分批发酵的优点在于：无菌要求低；菌种变异，退化少；适用范围更广。次级代谢酶的特异性较初级代谢酶的特异性低，故受遗传及环境因素的影响大。次级代谢物的合成途径比初级代谢的种类多，但大多数次级代谢物都是由少数关键中间代谢物组装的。次级代谢产物的合成一般是在生长期后，即培养基中的养分快耗尽，菌的比生长速率降低时才合成。 分解阻遏作用的解除主要是在多个碳源中选择慢碳源或者采用缓慢流加快碳源的工艺 n 引起发酵液中pH下降的因素 （1）C/N过高，或中间补糖过多，溶氧不足，致使有机酸积累，pH下降； （2）消泡剂加得过多：脂肪酸增加； （3）生理酸性盐的利用； （4）酸性产物形成：如有机酸发酵。n 引起发酵液中pH上升的因素 （1）C/N过低（N源过多），氨基氮（NH4）释放； （2）中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多； （3）生理碱性盐的利用； （4）碱性产物形成。 n 生长阶段：pH相对于起始pH有上升或下降的趋势 n 生产阶段：pH趋于稳定，维持在最适于产物合成的范围 n 自溶阶段：pH又上升 n 每一类菌都有其最适pH和能耐受的pH范围 细菌: pH 6.37.5 ；霉菌和酵母菌：pH 36；放线菌：pH 78n 控制一定的pH值，不仅保证微生物生长，而且防止杂菌感染 pH对生长的影响机制 对E合成的影响 对E活性的影响 对ATP生产率影响： 影响菌体细胞膜电荷状况，引起膜的渗透性的变化，因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的分泌。 影响培养基某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用 产物合成阶段的最适pH值和微生物生长阶段的最适pH往往不一定相同，这不仅与菌种特性有关，还取决于产物的化学特性。pH影响代谢方向： pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。pH对青霉素发酵的影响：在不同pH范围内加糖，青霉素产量和糖耗不一样。影响溶解氧（DO）的因素影响供氧的因素：C*- CL-温度、溶质、溶剂、氧分压，KLa-设备参数、操作参数、发酵液特性影响耗氧的因素：-菌种特性、培养基成分和浓度、菌龄、培养条件（T、pH）、代谢类型批式发酵无DO控制情况下，溶氧变化规律为“波谷现象” n 最适氧浓度（Cm）：溶氧浓度对产物合成有一个最适范围，CL过高或过低，对合成都不利。 n 中间补料是否得当可以从溶解氧的变化看出。n 发酵过程中出现“发酸”现象，此时溶解氧很快下降。 n 过高的溶氧水平反而对菌体代谢有不可逆的抑制作用n 供氧方面：n 提高氧分压（氧分含量），即 ，提高供氧能力n 改变搅拌转速：通过改变KLa来提高供氧能力 n 通气速率Ws ：Ws增加有上限，引起“过载”、泡沫n 提高罐压： ，但同时会增加CO2的溶解度，影响pH及可能会影响菌的代谢，另外还会增加对设备的强度要求。 改变发酵液理化性质（， ，Ii） 加消泡剂，补加无菌水，改变培养基成分改变KL 改变温度： ，提高推动力（C*CL） 耗氧方面 限制性基质的流加控制（补料控制）：在OTR一定情况下，控制基质浓度限制、x 限制 控制溶解氧溶解氧自动控制系统n 改变通气速率的溶氧控制系统 n 改变搅拌转速的溶氧控制系统n 改变通气量、转速、罐压所组成的多参数溶氧控制系统泡沫的产生 通气和搅拌 代谢气体的逸出 存在稳定泡沫的表面活性物质n 泡沫的类型 一类存在于发酵液的液面上。这类泡沫气相所占比例特别大，并且泡沫与它下面的液体之间有能分辨的界线。如在某些稀薄的前期发酵液或种子培养液中所见的泡沫。 另一类出现在粘稠的菌丝发酵液当中。这种泡沫分散很细，而且很均匀，也较稳定。泡沫与液体间没有明显的波面界限，在鼓泡的发酵液中气体分散相占的比例由下而上地逐渐增加。 泡沫的不利影响 降低了发酵罐的装料系数 增加了菌群的非均一性 增加了染菌机会 大量起泡引起“逃液”，导致产物的损失 泡沫严重时会影响通气搅拌的正常进行 消泡剂的加入将给提取工序带来困难发酵过程中泡沫的消长规律n 影响因素n 通气搅拌的强度n 培养基的配比及原材料组成n 培养基的灭菌方法和操作条件n 微生物代谢活动造成发酵液性质变化n 染菌 泡沫的控制 （1）机械消泡（2）化学消泡 （3）从微生物本身特性着手，防止泡沫形成 筛选不产生泡沫的微生物突变株 几种微生物混合培养发酵罐设计的基本原则 能否适合于生产工艺的放大要求 能否获得最大的生产效率清洁生产 (Cleaner Production) 是以节能、减耗和减少污染为目标，以管理、技术为手段，实施工业生产全过程控制污染，使资源利用最充分，污染的产生量最小化的一种综合性措施。 与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。 大规模动物细胞培养的工艺流程如图所示。工艺过程中，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心法收集细胞。将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞“种子”冷藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物的不同形式进行产物分离纯化。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强动物细胞合适的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对PH值也有不同的要求，原代培养细胞对PH值的变化耐受性差，传代细胞对PH值变化的耐受性较强。而对于同一种细胞，增长期和维持期的最适PH也不尽相同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。动物细胞的连续培养一般是采用灌注培养。采用灌注培养的优越性不仅在于大大提高了细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化。动物细胞培养的关键设备是细胞培养反应器,主要解决的共性问题都是要按照动物细胞的生长要求, 使反应器具备低的剪切效应、良好的传递效果和流体力学性质。植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。与动物细胞培养