基质固相分散–反相液相色谱测定蔬菜中二甲戊乐灵农药残留.doc

基质固相分散反相液相色谱测定蔬菜中二甲戊乐灵农药残留孙福生* 董杰 （苏州科技学院 环境科学与工程学院，苏州，215011）摘要：应用基质固相分散反相液相色谱技术建立了提取、检测蔬菜中二甲戊乐灵农药残留的分析方法。研究了不同的提取条件(萃取吸附剂、样品与吸附剂的比例、洗脱剂和用量等)及测定条件对检测二甲戊乐灵的影响，确定了最佳提取条件：萃取吸附剂是弗罗里硅土、样品与弗罗里硅土吸附剂的比例为1：4、20mL乙酸乙酯洗脱剂。二甲戊乐灵的测定线性范围为0.02-2.0mg/L、 r0.999。应用此方法测定了某些蔬菜样品中二甲戊乐灵农药残留，测定相对标准偏差为2.2-5.2。在几种蔬菜中的加标回收率为84.5-92.5，方法检出限在11-20mg/kg范围内。关键词：基质固相分散；二甲戊乐灵农药残留；反相液相色谱；蔬菜二甲戊乐灵是二硝基苯胺类选择性土壤处理除草剂, 是当前除草剂中杀草谱很广的除草剂之一，用于防除一年生禾本科杂草和某些阔叶杂草,除草效果好,安全性高,现已国产化并得到广泛应用。土壤对其吸附性强，不易淋溶，在土壤中移动性小。其农药残留对后茬作物会产生药害。二甲戊乐灵被认为是可疑的内分泌干扰剂和可能的致癌物质1。欧洲已有国家(组织)禁用或限用此农药,美国已对大豆中二甲戊乐灵残留量提出了严格的限制指标（0.1mg/kg）2。我国规定二甲戊乐灵在叶菜中的最高残留限量为0.2mg/kg，日本为0.2mg/kg （结球甘蓝）、韩国也为0.2mg/kg （包心菜）3。测定二甲戊乐灵农药残留所使用的仪器方法主要有气相色谱（GC）4-5、气相色谱-质谱（GC-MS）6-7、液相色谱(LC)8、液相色谱-质谱(LC-MS)7等法。在已报道的蔬菜中二甲戊乐灵农药残留的测定中，大多采用传统的液-液萃取(LLE)法提取样品中目标物，然后在旋转蒸发器中浓缩富集，如需要再经净化后进行测定3，5，9。这种方法需消耗大量有毒有害的有机溶剂,繁琐费时,而且在萃取过程中容易产生大量乳状液,影响萃取效率。自1989年美国Louisiana州立大学Barker教授首次提出基质固相分散（MSPD）技术10 后，已在蔬菜、水果等农药残留检测中得到一定的应用。这是一种崭新的固相萃取(SPE)新技术，其基本操作是将试样直接与弗罗里硅土和反相填料（如C18、C8等）研磨、混匀成半固态后装柱洗脱。MSPD简化了这类样品的传统处理中所需的样品均化、组织细胞破裂、提取、净化等过程，避免了样品均化、转溶、乳化、浓缩等造成的目标检测物的损失。应用MSPD样品处理并分析蔬菜中二甲戊乐灵残留鲜有报道，而张智超等报道了以涂敷AgNO3 的碱性氧化铝为分散剂的MSPD法提取、气相色谱/电子捕获检测器检测大蒜中痕量二甲戊乐灵残留的分析方法1。本研究采用MSPD技术，将蔬菜样品直接与弗罗里硅土研磨，优化了MSPD各种条件，并用反相液相色谱（RPLC）测定提取液中的二甲戊乐灵，其结果令人满意。1 实验部分_基金项目：江苏省环境工程重点学科建设项目（A0030803）作者简介：孙福生（1945- ），男，教授1.1 仪器与试剂用Agilent 1100液相色谱仪（美国加利福尼亚安捷伦技术公司）分离检测二甲戊乐灵，它由一个四元泵、真空脱气器、恒温柱箱和可变波长检测器组成。使用Rheodyne型号7125手动进样器（美国加利福尼亚Rheodyne公司）和20微升定量管进样。色谱柱是Hypersil柱（2004.6 mm i.d.，5m ODS C18微粒，美国安捷伦公司）。用甲醇溶解二甲戊乐灵标准品（99，江苏龙灯化学有限公司）并定容配置成10000mg/L标准储备液；二甲戊乐灵标准系列溶液是用甲醇逐级稀释标准储备液而得。甲醇、乙腈（色谱纯，Merck，Germany）；乙酸乙酯（分析纯，天津市福晨化学试剂）、正己烷、二氯甲烷、甲苯（分析纯，上海化学试剂有限公司），使用前重蒸并过0.45m滤膜。弗罗里硅土（Florisil分析纯，国药集团化学试剂有限公司，100-200目，130C活化4-6小时；无水硫酸钠（分析纯，上海化学试剂有限公司，于马弗炉450C活化4小时；C18填料（40-63mm，60，SILICYCLE），使用前先进行活化处理，方法如下：在50mL玻璃注射器内装入2.0 gCl8，分别用2倍柱体积的正己烷、二氯甲烷和甲醇依次洗涤，真空干燥，贮于试剂瓶内备用。实验用水为Milli-Q超纯水（Milipore，USA）。1.2 色谱条件7采用Agilent 1100可变波长紫外检测器对100 mg/L二甲戊乐灵标准溶液进行波长扫描，确定最佳检测波长为235nm。对10 mg/L二甲戊乐灵标准溶液进样，确定最佳色谱条件：流动相为100%甲醇，流速0.8mL/min，柱温25C。在该条件下，图1为10 mg/L二甲戊乐灵标准溶液的色谱图，二甲戊乐灵的保留时间为2.994min。图 1 二甲戊乐灵色谱图 Fig.1 Chromatogram of pendimethalin1.3 MSPD操作步骤取蔬菜样品若干，用榨汁机打成均匀浆状，准确称取0.5g匀浆于玻璃研钵中，加入2.0g已活化的弗罗里硅土作为分散剂，充分研磨至样品颗粒完全分散在弗罗里硅土中，待装柱。取10mL注射器，底部填入少量脱脂棉后再放一滤纸片，加入2.0g无水硫酸钠，然后将上述研钵中的混合物均匀地倒入注射器装柱，边装边敲实此柱，再加入1.0g无水硫酸钠，上端再放一滤纸片，用活塞适度压实样品，取出活塞。用20mL乙酸乙酯洗脱剂分3次洗脱，烧杯接收洗脱液。40水浴，氮吹仪吹干洗脱液；用2mL甲醇溶解杯中残留物，并经0.45m针头过滤器滤至2mL定量管中定容，待测定。2 结果与讨论2.1 基质固相分散萃取蔬菜中二甲戊乐灵条件的选择和优化在基质固相分散萃取中，固相萃取材料的选择、洗脱剂的极性和用量、样品与固相萃取材料的比例是影响前处理效果的4个最主要因素，只有优化了这些参数才能同时得到理想的净化效果和回收率。固相萃取材料和洗脱剂的选择直接关系到检测结果的准确性，选择正确的洗脱剂和固相萃取材料的组合，能有效提高检测方法的准确性。合适的固相萃取材料可以把目标农药有效提取出来，而较少提取油脂、蛋白、色素等杂质；合适的洗脱剂能将目标农药从净化柱上彻底洗脱下来，而将油脂、蛋白和色素等杂质保留在净化柱上，因此合适的固相萃取材料和洗脱剂及其用量对蔬菜中残留农药的提取、分离净化是至关重要的。除非另有说明，所有条件的选择和优化结果都是用山药样品，添加二甲戊乐灵的浓度为1.0mg/kg，进行三次平行样测定的平均值。2.1.1 基质固相分散萃取吸附剂的选择在基质固相分散中，固相萃取吸附剂同时起着支持剂、吸附剂、净化剂的作用，待测农药在填料与样品基质之间进行吸附与分配，最终达到提取与净化双重效果。对C18和弗罗里硅土两种吸附剂对检测结果的影响进行了试验，其加标回收率分别为78.8%和90.2%，而相对标准偏差分别为2.3%和1.5%。由此可见，对提取蔬菜中二甲戊乐灵农药来说，弗罗里硅土吸附剂更合适。2.1.2 样品与吸附剂量的比率选择 样品与吸附剂量的比率对分析结果影响很大。文献报道，样品和键合相载体的最佳比率是1:4，大多数MSPD柱中典型的样品用量为0.5g11。分别试验了样品与弗罗里硅土吸附剂量的比率为1：2，1：3，1：4和1：5，其结果列于表1。从结果看，当样品与吸附剂的比率从1；2逐步提高到1；4时，二甲戊乐灵的回收率也随着增加；但样品与吸附剂比表 1 不同样品-吸附剂比率对二甲戊乐灵回收率的影响Tab. 1 Effect of different ratio of sample-sorbent on recovery of pendimethalin样品-吸附剂比率二甲戊乐灵回收率，%RSD，%1：269.12.51：378.43.71：490.21. 51：588.53.3率提高到1：5时，其回收率反而降低。1：4时二甲戊乐灵回收率和测定的RSD最佳，此与文献报道的结果吻合。所以，确定样品与弗罗里硅土吸附剂量的比率为1：4。2.1.3 洗脱剂和用量的选择理想的洗脱溶剂应满足以下两个要求:(1)溶剂强度足够大，即使用该洗脱溶剂时分析物的保留因子KW尽可能小;(2)溶剂应与后续的检测方法相适应12。分别试验了正己烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯对二甲戊乐灵的洗脱效果，其结果见图2。由图2可见，正己烷为洗脱剂时洗脱不完全，加标回收率偏低；甲醇和乙腈为洗脱剂时加标回收率已大于70%，二者效果基本相当；而乙酸乙酯对二甲戊乐灵的洗脱效果最好，加标回收率已大于90%。因此确定乙酸乙酯为本工作的洗脱剂。洗脱剂的用量以既能对目标分析物有很好的溶解、洗脱能力，同时又能对基质杂质洗脱较少为准则。图3是乙酸乙酯洗脱剂用量对影响洗脱二甲戊乐灵农药的曲线图。由图3可看出，随着乙酸乙酯用量的增大二甲戊乐灵的回收率也增大；当用量为20mL时，其回收率已高于90%；但当用量继续增加时，回收率增幅趋于平缓。所以，本研究选择乙酸乙酯洗脱剂的用量为20mL。2.2 二甲戊乐灵测定的线性范围用甲醇稀释二甲戊乐灵标准储备液，配制不同浓度的二甲戊乐灵标准溶液，在相同的色谱条件下进行测定，其线性范围为0.02-2.0mg/L，r0.999。图2 洗脱剂的选择Fig. 2 Selection of eluting solvent图3 洗脱剂用量对萃取效率的影响Fig. 3 Effect of amount of eluting solvent on extraction efficiency2.3 样品测定、加标回收率、精密度和检出限在马铃薯、胡萝卜和山药样品中分别加入不同量的二甲戊乐灵标准溶液，用上述研究的方法测定了样品。以胡萝卜样品为例，加标前后经MSPD萃取后洗脱液的色谱图分别描绘于图4(a)和图4(b)中。比较这二张图可见，在约3min处，能明显看到加标后的色谱图上增加的那个峰即二甲戊乐灵。根据测定结果，计算了加标回收率、测定精密度和检出限（S=3s），其结果列于表2。由表2可知，三种样品的不同加标量的加标回收率和测定的相对标准偏差（RSD）分别在84.5-92.5%和2.2-5.2%范围内。对添加低浓度水平的样品的测定，计算得到的方法检出限在11-20mg/kg范围内。在三种样品中二甲戊乐灵农药残留量均小于方法检出限，未检出。 3 结论本文研究了以弗罗里硅土为基质固相萃取吸附剂，乙酸乙酯为洗脱剂的基质固相分散萃取富集蔬菜样品中二甲戊乐灵农药残留的前处理方法，并结合高效液相色谱法和外标法定性定量测定几种蔬菜样品中二甲戊乐灵农药的方法。样品前处理简便快速，不需要特殊的仪器设备，有机溶剂用量较少，成本低，方法的推广性强。基质固相分散萃取富集蔬菜样品中二甲戊乐灵的最佳条件如下：样品与弗罗里硅土吸附剂的比率为1：4（0.5g样：2g弗罗里硅土）；洗脱剂为20mL乙酸乙酯，分3次加入。色谱最佳条件：流动相100%甲醇、流速0.8mL/min、柱温25C、检测波长235nm。二甲戊乐灵的测定线性范围为0.02-2.0mg/L、 r0.999。在几种蔬菜中的加标回收率在84.5-92.5范围内，测定相对标准偏差为2.2-5.2；方法检出图4(a) 胡萝卜MSPD萃取后洗脱液色谱图Fig. 4(a) Chromatogram of elution solution after extraction of carrot by MSPD图4(b) 加标胡萝卜MSPD萃取后洗脱液色谱图Fig. 4(b) Chromatogram of elution solution after extraction of spiked carrot by MSPD表2 样品测定结果 (n=6)Tab. 2 results of determination of samplesmg/kg样品名称样品测得量加标量测得加标量SD回收率，%RSD，%DL（S=3s）马铃薯-200171685.53.518-10008864688.65.2-20001.79x1036x1089.53.4胡萝卜-200169884.54.720-10008842888.43.2-20001.78x1034x1089.02.2山药-200179689.53.411-10009082490.82.6-20001.85x1034x1092.52.2“-”：未检出。 限为11-20mg/kg。参考文献1张智超，曾 敏，李朝阳等. 农药学学报，2005，7（3）：2642 霍江莲, 李军，葛毅强等. 分析化学，2006，34(特刊)：S633 黄雅丽，毛黎娟，吴慧明等. 农业环境科学学报, 2004，23（6）：11474李菊清，周孝瑞，曾仲武. 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The effects of different extraction conditions (extraction sorbent, ratio of sample to sorbent, eluting solvent and their amount, and etc.) and determination conditions were studied; and the op