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ZnSe纳米晶体阳离子交换反应用于生物检测中的信号放大-读后感作者：彭昆 学号：2009111075 班级：化学班所有科学研究最终的目的就只有一个促进社会进步！所以此处我会首先着手于此篇文献中涉及到的科学应用，然后再从其原理和相关优势方面一一展开阐述。应用：ZnSe纳米晶体阳离子交换反应，在诸如系统生物学、医疗保健、产品质量控制、环境检测和生物防卫等很多领域中分子测量都很重要。人一天摄入Zn2+超过10mg的水平对健康的威胁很低，环境保护局（EPA）也没有规定Zn2+的摄入上限。而在人血清蛋白中，能使用此方法检测到大量的基底蛋白，不过亦得益于基底蛋白具有低干扰和准确量化的特性。原理: 密封分子实现体外检测信号放大的简便方法.充分利用了每个离子纳米晶体（NC）里数以千计的离子外壳的自身优势和高表面活性。所附的阳离子能够通过阳离子交换反应（CX）快速释放出来，然后会依次跟金属相应染料发生反应。所得到的标记率的值大于1000:1。每一个目标-报道结合过程能够放大一千多倍。实例：通过使用CdSe的阳离子交换信号放大方法成功检测到了提取的人类RNA中全部的microRNA，其检出限为35 fM。较为温和的CX反应不包括强酸和腐蚀性氧化物，这使以金属响应染料作为信号产物成为可能。这种方法快速，能够进行原位检测。优势:ZnSe纳米结晶的阳离子交换反应具有较高的信号放大率和很好的生物相容性;阳离子交换信号放大能直接用于生物检测格式和光学检测平台，对仪器不需要特殊要求，不必进行实验设计;跟其他纳米基底敏感技术相比，阳离子交换信号放大最卓越的特性在于纳米晶体独特的光学性质。因此，选择和修饰纳米晶体时，以及在实现检测性能的高灵敏性、高稳定性和极好的生物相容性等多种金属响应荧光染料的性能时将会有很大的选择空间;ZnSe 纳米晶体的阳离子交换信号放大的检测性能优于荧光染料、量子点和HRP的检测性能，能用于人血清免疫球蛋白E（IgE）的定量分析；优化FluoZin-3的荧光条件，在Zn2+的影响下FluoZin-3的量子产率能从小于0.005增加到0.43，它也有个比较低的解离常数15nM，每一纳秒范围内的结合速率常数。所有这些性质决定了在阳离子交换后能有强的荧光产生。综述个人观点：此篇文章主要阐述了光化学方面的灵敏度、选择性被提高后所带来的收益，同时在实验中发现相关的不足从而去改善和优化。比如此文中说：具有高量子产率的荧光染料是最普通的光学标记物，但其每一个报道分子仅仅能结合5个染料分子。当示踪目标物在阵列表面捕获非常少的报道分子的时候，常常因为标签率低而使产生的荧光信号很难从背景噪音中分辨出来。虽然量子点（QDs）的效率比有机染料会高出5-20倍但具有生产成本高、淬火后表面发光功能化、生物耦合以及有毒元素镉会对环境危害等缺点。由无毒材料制成的量子点跟那些含有Cd的物质相比还没有表现出比较敏感的性能。而ZnSe纳米晶体阳离子交换反应就克服了上述的所有缺点。所以我觉得一切事物的进展都是在发现它的不足时去进一步改造优化的，没有天生完美无缺，不过发现问题的眼光和以勇气、执著着的心去改造更重要。而作为一个与科学打交道的人更应如此，去不断地提高、总结、优化！Cation Exchange in ZnSe Nanocrystals for SignalAmplication in BioassaysJingjing Yao, Samantha Schachermeyer, Yadong Yin, and Wenwan ZhongDepartment of Chemistry, University of California, Riverside, California 92521-0403, United StatesAnalytical Chemistry,Vol.83, No.1,402408. January 1, 2011ZnSe纳米晶体阳离子交换反应用于生物检测中的信号放大Jingjing Yao, Samantha Schachermeyer, Yadong Yin, and Wenwan Zhong（加利福尼亚大学滨河分校化学系, 加利福尼亚92521-0403, 美国）发表日期：2011年1月1日 来源：美国分析化学杂志83卷第1期，402-408页ZnSe纳米晶体具有较低的本底荧光和很好的生物兼容性，在生化检测中常用作标记物。一个ZnSe纳米晶体能够释放出3000多个Zn2+，因此它的阳离子交换反应(CXAmp)能够成百数千倍地放大目标识别信号。自由阳离子能够从Zn响应染料中依次激发强的荧光信号。据最近的研究显示，与传统的标记方法相比，ZnSe的阳离子交换具有卓越的检测性能。5nM的ZnSe纳米晶体阳离子交换的荧光强度是同样浓度CdSe/ZnS核-壳量子点荧光强度的30倍。ZnSe纳米结晶的阳离子交换反应的检出限（LOD）比使用辣根过氧化酶（HRP）标记法的检出限低10倍，检测灵敏度信号浓度曲线的斜率是后者的20倍。当使用夹心法检测免疫球蛋白E（IgE）时检测限可以达到1ng/mL，高灵敏的阳离子交换信号放大同样能够检测人血清中免疫球蛋白E的总浓度。在人血清蛋白中，能使用此方法检测到大量的基底蛋白，这得益于基底蛋白具有低干扰和准确量化的特性。除具有较高的信号放大率和很好的生物相容性外，ZnSe的阳离子交换信号放大能很容易适应普通实验设计，能够用于普通实验系统中低浓度目标物的可靠检测。在诸如系统生物学、医疗保健、产品质量控制、环境检测和生物防卫等很多领域中分子测量都很重要的。1-5然而，超灵敏检测对其来说仍然是一个挑战，主要是因为以前报道分子的标记效率非常低。例如，具有高量子产率的荧光染料是最普通的光学标记物，6-8但其每一个报道分子仅仅能结合5个染料分子。当示踪目标物在阵列表面捕获非常少的报道分子的时候，常常因为标签率低而使产生的荧光信号很难从背景噪音中分辨出来。9,10虽然量子点（QDs）的效率比有机染料会高出5-20倍，9,11但具有生产成本高、淬火后表面发光功能化、生物耦合9,12,13以及有毒元素镉会对环境危害等缺点。14-15由无毒材料制成的量子点跟那些含有Cd的物质相比还没有表现出比较敏感的性能。9,14另一方面，可以使用银纳米粒子通过表面等离子体振动方法来增强荧光。观察显示效率能提高3-10倍。16-18另外，其他一些技术也已经应用于信号放大检测。最常见的方法是利用辣根过氧化物酶（HRP）的酶标记法。每个酶可很大程度上催化色分子或化学发光分子的产率，降低检测限达10-100pM。或者，核酸能够通过检测前的聚合酶来放大，但聚合酶反应不能直接适用于无核酸分子中，还能受到集中背景污染物和冗长液体处理的破坏。25-28另外，掺杂了染料的二氧化硅纳米颗粒的生物酶，因为在其内部每一个颗粒物上封装大量染料从而也增强标记率。29,30然而，实验中仍然需要尽量避免染料渗漏和非特异性结合到二氧化硅表面，而在靶结合部位上如果结合体积较大的粒径（30- 60nm），甚至阻止结合位点可诱导产生位阻现象。29我们团队建立了一种使用密封分子实现体外检测信号放大的简便方法。这种方法充分利用了每个离子纳米晶体（NC）里数以千计的离子外壳的自身优势和高表面活性。31所附的阳离子能够通过阳离子交换反应（CX）快速释放出来，然后会依次跟金属相应染料发生反应。所得到的标记率的值大于1000:1。每一个目标-报道结合过程能够放大一千多倍。首次报道以纳米晶体阳离子交换为基础的信号发放大的方法是使用CdSe纳米晶体，它的信号强度和检测限分别比使用Alexa Fluor 488 高60倍和低100倍。通过使用CdSe的阳离子交换信号放大方法我们成功检测到了提取的人类RNA中全部的microRNA，其检出限为35 fM。较为温和的CX反应不包括强酸和腐蚀性氧化物，这使以金属响应染料作为信号产物成为可能。这种方法快速，能够进行原位检测。在CX缓冲溶液中混合纳米晶体可使荧光信号在20s内达到最大值的80%（没有确切数据）。另外，阳离子交换信号放大能直接用于生物检测格式和光学检测平台，对仪器不需要特殊要求，不必进行实验设计。跟其他纳米基底敏感技术相比，阳离子交换信号放大最卓越的特性在于纳米晶体独特的光学性质。因此，当我们选择和修饰纳米晶体，以及在实现检测性能的高灵敏性、高稳定性和极好的生物相容性等多种金属响应荧光染料的性能时将会有很大的选择空间。Schematic Illustration of CXAmp with ZnSe NCsaScheme 1. The secondary antibody was labeled with ZnSe NCs, which, after target binding, would undergo CX reaction with the added Ag+and released Zn2+. The freed Zn2+ would then bind to the poorly luminescent FluoZin-3, and the Zn- FluoZin-3 complex emits strong uorescence. 自CdSe的阳离子交换信号放大发展和应用以来，我们在目前的研究中取得了很大的技术进步：使用ZnSe 纳米晶体进行阳离子交换信号放大（如设计图1所示）。使用生物兼容性好的ZnSe 纳米晶体使其毒性大大降低。ZnSe 纳米晶体的阳离子交换信号放大的检测性能优于荧光染料、量子点和HRP的检测性能，能用于人血清免疫球蛋白E（IgE）的定量分析。此外，我们使用一项在检测和储存情况下阳离子交换信号放大条件和纳米晶体稳定性的细致研究来确认我们的方法的稳定性。实验部分化学试剂和材料。用于制备纳米结晶、溶剂和配体的各种化学试剂采购自费舍尔科学公司。胺标低聚核苷酸采购自综合DNA科技公司（Coralville, IA），没有进一步纯化。人免疫球蛋白G（IgG）、被HRP修饰或没被其修饰的基抗体和辅抗体、Qdot525nm（QD）和FluoZin-3均购自Invitrogen（卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。人血清免疫球蛋白E采购自雅典研究和技术公司（雅典，佐治亚州）。Lonza Biowhittaker人血清由费舍尔科学公司提供。ZnSe纳米结晶的合成与特性。水溶性的ZnSe 纳米晶体是是修改先前报道的CdSe 纳米晶体的合成路线，在水溶液中合成的。合成的细节和纳米晶体的性质请参阅支持信息中。抗体或氨标聚核苷酸和纳米晶体的生物耦合技术。山羊抗人免疫球蛋白G (anti-IgG)或抗-人血清免疫球蛋白E通过1-乙基-3-（3-（二甲氨基）丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和磺基-N-羟基（磺酸基-NHS）耦合到ZnSe纳米晶体上。在ZnSe表面的巯基丙烯酸（MAA）分子为耦合提供羧基官能团。包含了大约1014个纳米晶体的ZnSe粉末，在5L的去离子水中第一次悬浮，用0.4mgEDC和1.1mg的磺酸基- NHS在1mL的链接缓冲溶液(0.1 M NaH2PO4-Na2HPO4 (pH 7.2)中活化15分钟。在添加100L的抗-人血清免疫球蛋白G (1 mg/mL)或抗-IgE (1 mg/mL)防止蛋白交联之前，剩余的EDC使用1.2L的巯基乙醇进行淬火处理。将混合物在室温（RT）下搅拌3小时。最后，使用Amicon离心过滤器将耦合的ZnSe纯化，并保存在100L 0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液中（pH值7.2）。使用前将原料稀释100倍。耦合在ZnSe纳米晶体上使用3胺标的27 nt DNA 使用同样的步骤处理。将抗体共轭到量子点上使用的是生产商建议的一步反应过程。将大约1014个量子点同0.2mg的EDC和100L 1mg/mL的抗体在1mL的连接缓冲液中混合。混合物在室温下搅拌3h，使用YM-100过滤器纯化并保存在100L 0.1 M的磷酸盐溶液中。检测时将共轭在量子点上的原料稀释15倍。使用Cary紫外-可见分光光度计（瓦里安，加利福尼亚州），键合到ZnSe纳米晶体和量子点上的抗体大概在350nm处（纳米晶体的特征吸收峰）和280nm处（既包括纳米晶体也包括蛋白质的信息）有吸收峰，ZnSe 纳米晶体和量子点共轭给出的结果是抗体和纳米晶体的摩尔比接近45：1。因为YM-100过滤器不能够完全地移除自由抗体分子。这个数值不能反应每个纳米晶体中人血清免疫球蛋白G的真实数目，只能用于估算纳米晶体的总数和检测中用到的抗体数。免疫分析和荧光检测。二元检测法和夹心检测法都使用96孔微孔板进行检测。在二元检测中使用人血清免疫球蛋白G将细孔覆盖一整夜并保持温度在4C，然后室温下在磷酸盐缓冲液（PBS）中使用1%的牛血清白蛋白（BSA）将细孔阻塞30分钟，这些操作都是在100L使用HRP、ZnSe、荧光素，或量子点标记的抗-人血清免疫球蛋白G在37C保温1h前进行的。HRP-和荧光素-标记的抗免疫球蛋白G从1mg/mL生产商建议的原料中分别稀释4000倍或40倍。夹心法检测人血清免疫球蛋白E时，使用100L山羊抗-人血清免疫球蛋白E（10mg/mL）将平板整夜覆盖并保持温度在4C，并使用1%BSA阻塞平板。这样，不同浓度的人血清免疫球蛋白E会加到平板上，并在37C下保温1h。在PBS/BSA（1%）中将100L ZnSe-抗人血清免疫球蛋白E（将原料稀释100倍）使用PBS洗涤若干次，再将其装填到每一个小孔中，37C下保温1h。再一次使用洗涤步骤洗去残留标记抗体。将100L 2mM的H2O2和2mM ABTS 加入到细孔中会使HRP的吸收信号增强。在吸光度在平板读出装置中测量出前反应在室温下进行了20分钟。阳离子交换信号放大的信号输出和加入含有500M AgNO3 and 3M FluoZin-3的100 L of 10 mM HEPES步骤是同步的。一个485 nm的激发滤光器和一个530/30 nm发射滤波器用于检测FluoZin-3。除了405nm的激发滤光器用于量子点检测，其他情况下使用同样的滤光器测量量子点和使用去离子水作为检测溶液的荧光素的信号。FluoZin-3和阳离子反应信号放大的荧光光谱使用的是Spex FluoroLog Tau-3荧光分光光度计（HORIBA Jobin Yvon的公司，新泽西州），激发波长为488nm。使用2nm宽度的狭缝收集从505nm到550nm的发射光谱，量子点的激发光谱在350 nm处，据记载在使用2nm宽度的狭缝时发射光谱是从505nm到550nm。ZnSe纳米晶体的激发光谱在350 nm处，据记载在使用10nm宽度的狭缝时发射光谱是从385nm到450nm。所有记录的数据都是三次测量结果的平均和标准偏差。结果与讨论Zn2+荧光信号的最大化。人一天摄入Zn2+超过10mg的水平对健康的威胁很低，环境保护局（EPA）也没有规定Zn2+的摄入上限。35,36因此，以锌为基础的纳米结晶是提高阳离子交换信号放大生物兼容性的可选材料。因为阳离子交换信号放大是以荧光素结合释放的自由Zn2+而产生的荧光为基础的，所以阳离子交换信号放大的最低检测限和线性范围是由Zn-响应燃料的性能决定的。过去几十年发展了大量的荧光Zn2+传感器，37-41本次研究我们选择了FluoZin-3。在Zn2+的影响下FluoZin-3的量子产率能从小于0.005增加到0.43，它也有个比较低的解离常数15nM，每一纳秒范围内的结合速率常数。37所有这些性质决定了在阳离子交换后能有强的荧光产生。 Figure 1. (a) Detection of Zn2+ with 0.5, 3, or 5 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES at pH 7.4 (b) Detection of Zn2+ with 0, 1, 10, 25, and 50 M EDTA in 10 mM HEPES at pH 7.4 containing 2 mM Ca(NO3)2 , 2 mM Mg(NO3)2 , and 3 M FluoZin-3.我们进行试验的第一步是优化FluoZin-3的荧光条件。在阳离子交换器中应放入合适浓度的FluoZin-3以便结合所有释放出的Zn2+并确保宽的检测范围，但是过高的染料浓度将不可避免地增加背景值。我们在pH为7.4的10mM HEPES的缓冲溶液中测试了FluoZin-3的三种不同浓度(500 nM and 3 and 5 M)对较大Zn2+浓度范围的荧光响应曲线。之所以选择HEPES为缓冲体系是因为HEPES能提供一个合适的pH范围使FluoZin-3放出强荧光。HEPES同样不会和Ag+反应也不会干扰阳离子交换反应。如图1a所示，在Zn2+达饱和浓度10M时，3M的FluoZin-3具有最宽的线性范围和最大的信噪比（S/B 86）。虽然5M的FluoZin-3在高浓度的Zn2+体系中能发出更强的荧光，但由于染料的自体荧光会使背景值也随之上升，在5 M Zn2+时信噪比会降到60（如支持信息图S1所示）。3M和500 nM的FluoZin-3的背景信号具有可比性。因此，考虑到能提供的较大的性噪比和较宽的动力学范围，在以下的测试中我们选择浓度是3M的FluoZin-3。在使用阳离子交换信号放大检测追踪产物时，较低的Zn的检测限也是要考虑的一个因素。伴随着大量FluoZin-3分子产生的荧光，降低阳离子交换信号放大的检测限的关键是降低背景荧光值。从实验室一般玻璃仪器泄露出来的Zn2+，或作为制备缓冲溶液盐类中的杂质，在没有纳米晶体存在的情况下都能产生较强的背景值。有文献报道在检测细胞Zn2+时，使用CaEDTA可以掩蔽背景荧光信号。在没有CaEDTA或者在不同浓度的CaEDTA的情况下我们使用CaEDTA滴定Zn2+，然后比较了它们的荧光信号。当Zn2+的浓度达到5nM时， EDTA的存在事实上既增加了背景值也增加了荧光信号，但是不管有没有EDTA，使用了FluoZin-3的Zn2+的检测限仍然具有可比性（如图1b所示）。100 pM 的Zn2+也可以检测到。然而，当Zn2+的浓度增加到50 nM以上时，由于EDTA 和FluoZin-3会竞争吸附锌离子（如支持信息图S2a所示），荧光信号随着EDTA的量的增加而减小。而且，在EDTA存在的情况下信号的强度会变得不稳定。当溶液中EDTA的浓度达10M时，在前5分钟的滴定中，100 nM Zn2+产生的荧光信号降低8%，当EDTA的浓度大约在25M时会损失50%的信号（如支持信息图S2b所示）。这个结果证明，尽管EDTA是一种比FluoZin-3更慢的Zn2+螯合剂，在开始时大多数自由的Zn2+会跟FluoZin-3结合，但由于在溶液中的高浓度，最终EDTA会结合更多的Zn阳离子。因为我们能在没有CaEDTA存在的情况下可以获得稳定的荧光和较低的Zn2+检测限，所以我们在阳离子交换信号放大的溶液中没有选择CaEDTA。使用ZnSe纳米晶体进行信号放大。水溶性的ZnSe纳米晶体据测量是立方体形的，用分子式表示是ZnSe0.64，平均尺寸是51nm（如支持信息图S3，a、b所示）。ZnSe纳米晶体在350nm激发时在400nm发射非常低的荧光（如支持信息图S3c所示）。使用水溶性合成路线制备的纳米结晶具有相对较宽的粒径分布，仍然伴随着低量子产率；但它们不在阳离子交换信号放大中考虑。考虑到ZnSe 5.27 g/cm3的密度和立方晶体的理想结构，每5nm的ZnSe0.64 的立方晶体包含了大约3400个Zn2+。在以上的优化锌检测条件下，5 nM ZnSe纳米结晶产生的信号是FluoZin-3自体荧光（488 nm激发）的60倍，是5nM CdSe/ZnS核/壳结构量子点525nm荧光信号（350nm激发）的30倍（如图2所示）。溶液中存在ZnSe纳米晶体，强荧光使得其检测限低达30 fM（如支持信息S4所示），相应地Zn2+的检测限低达100 pM。图2中包含在纳米晶体悬浮液中的Zn2+使用诱导耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）证实。更进一步，由纳米晶体表面修饰引起的阳离子交换效率的改变是可以忽略不计的。没被键合的和键合了DNA或抗-免疫球蛋白E的ZnSe纳米晶体在Zn(Ac) 2溶液中经过阳离子交换信号放大后的曲线很好的重合（如图3所示），这说明阳离子交换效率接近100%。所有的数据都是在阳离子交换溶液中2分钟内采集的。Figure 2. Fluorescence spectra of 5 nM QDs in DI water and 5 nM ZnSe after the CXAmp with 500 M Ag+ and 3 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4. The autouorescence of FluoZin-3 was measured in the CXAmp buffer. Figure 3. CX efciency in ZnSe NCs without or with different surface modication, i.e., 27 nt DNA and ZnSe - IgG. Zn content in NCs was determined by ICP-AES. The CXAmp buffer contained 500 M Ag+ and 3 M FluoZin-3 in 10 mM HEPES buffer, pH 7.4. 在使用ZnSe纳米晶体进行生物传感时，ZnSe纳米晶体会随之溶解是个很大的问题，因为这会降低纳米结晶的总数，对检测的有效性产生影响。与更大颗粒的晶体相比，纳米结晶大的比表面更能增加溶解性。ZnSe的溶解度是1.9 10-10 M。考虑到每个ZnSe纳米晶体中包含的Zn2+的总数，这个溶解度可以认为是在检测过程中ZnSe纳米晶体的浓度应该保持在0.56 pM以上，防止纳米晶体的溶解损失。另一个溶液情况，例如pH值和盐分，会影响溶解平衡和改变溶解度。因此我们在典型的免疫分析和保存条件下测试了纳米晶体的稳定性。这个测试是在10 000 Da (YM-10)在NMWC中使用 Amicon 滤光片来从完整的纳米晶体中分离溶解在溶液中的金属离子。在使用YM-10过滤完ZnSe-抗免疫球蛋白E的存储溶液后，从ZnSe纳米晶体中释放的Zn2+会流过色谱柱，而完整的ZnSe-抗免疫球蛋白E键合体会保留在过滤器的顶部。随后，在有500 M Ag+和3 M FluoZin-3的情况下使用荧光检测存在Zn2+的上清液和流出液，用FluoZin-3的荧光强度对Zn2+的浓度作标准曲线图。因为ZnSe -抗免疫球蛋白G的阳离子交换效率接近100%，溶解的和没有溶解的ZnSe纳米晶体的数目能够用锌离子的浓度除以3400的比值很容易地计算出来。为了评估ZnSe -抗免疫球蛋白G在常规免疫检测中的稳定性，微粒必须保存在PBS缓冲溶液中，溶液也必须每隔1h取一次样。只有微量的ZnSe -抗免疫球蛋白G共轭体会在5h的检测期间里以锌离子的形式（如支持信息图S5a所示）溶解并留出过滤器。这种持续时间接近真实的一般免疫检测的持续时间。另一方面，通过测量发现，保留在Amicon lter顶部的ZnSe -抗免疫球蛋白G共轭体的数目是个常数。而且研究证明，ZnSe -抗免疫球蛋白G在0.1 M pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液中具有长期的稳定性。纳米晶体每隔一周取一次样这样持续一个月。再次观察发现没有Zn2+泄露出来（如支持信息图S5b所示）。高稳定性可以归因于覆盖试剂MAA的使用。它和ZnSe纳米晶体表面的锌能很好地协调，而且能够提供足够多的负电荷使纳米晶体在水溶液中自由分配。随着抗体与ZnSe纳米晶体共轭使阳离子交换反应快速完整地进行和在检测保存中令人满意的稳定性，ZnSe纳米晶体能够在免疫分析中用作标记物。Figure 4. Relative change of signal over background of IgG detection by comparing ZnSe NCs based CXAmp to ELISA. ZnSe阳离子交换信号放大的检测性能。酶联免疫分析测定(ELISA)是以酶为信号放大因素提供低检测限的免疫分析的黄金法则。因此，为了能更好地评估阳离子交换信号放大卓越的检测性能，我们比较了ZnSe阳离子信号放大和酶联免疫分析测定中最常用的辣根过氧化酶信号放大的性能。结果显示，山羊抗人免疫球蛋白G既能跟辣根过氧化酶标记也能跟ZnSe纳米晶体标记。两种标记方法的信号放大效率用信号对背景的相对变化即(信号-背景)/背景100%来表示，如图4所示就是其对免疫球蛋白G浓度的曲线图。很明显地可以看到阳离子交换信号放大的信号值比用辣根过氧化酶标记的信号值上升地更快，它们都有一个可比较的动态范围。阳离子交换信号放大也有一个非常低的检测限。10 ng/mL免疫球蛋白G的量能经过阳离子交换信号放大很明显地检测到，这个值比我们以前报道的CdSe阳离子交换信号放大所得到的检测限低5倍。31计算出的上述（黑色，HRP）检测限（LOD，等于3倍的标准偏差(SD)）是3.7ng/mL（如支持信息图S6a所示）。阳离子交换信号放大也具有很好的检测重现性，相对标准偏差（SRD）的平均值为2%。与此相对，使用辣根过氧化酶标记的检测免疫球蛋白G的最低限度是50 ng/mL，计算得出的检测限是34 ng/mL，相对标准偏差的平均值为6%（如支持信息图S6b所示）。如图S6所示两条标准曲线的斜率也显示出在检测免疫球蛋白G时，阳离子交换信号放大比辣根过氧化酶灵敏20倍。另外，对量子点和使用荧光染料标记物性能的检测分别使用的是QDot525nm和荧光标记山羊抗人免疫球蛋白G。但这两者在最低可检测10 g/mL的免疫球蛋白G时显示比较差的灵敏度。低灵敏度同样会导致较窄的检测范围和测量中显著的大标准偏差值（如支持信息图S7所示）。通过夹心检测法使用ZnSe阳离子交换信号放大对免疫球蛋白E进行检测。上述免疫球蛋白G的检测性能是二元相互作用格式的一种形式。更通常的做法是夹心检测用于阵列传感器。因此，为了更进一步地展示ZnSe阳离子交换信号放大在生物分子检测中的性能，在夹心法检测中我们将它作为一种样品抗原用于人免疫球蛋白E的检测。免疫球蛋白E是人体5种同型免疫球蛋白(Igs)中的一种。31跟其他的免疫球蛋白相比，体内的免疫球蛋白E的浓度非常低。例如，免疫球蛋白E在冷血液中的浓度低于1 U/mL (1 U =2.4 ng)。免疫球蛋白E浓度上升通常跟过敏性失调疾病有关，例如过敏症、免疫缺陷综合征或其他炎症。在大多数放射免疫鉴定法中，检测限低达0.5 U/mL (1.2 ng/mL)。43过敏原特异性免疫球蛋白E数量的定量仍然需要技术在自动化、精度、周转时间和灵敏度方面的改进，以便在临床重要的工作中精确测量免疫球蛋白E。44Figure 5. Human IgE detection by ZnSe NCs based CXAmp with a sandwich assay format. 免疫球蛋白E分子包含有两个完全相同的抗免疫球蛋白E抗原决定簇FcRI位点和FcRII位点对称地位于两个-重链旋转轴中心部位。45因此，可以预期能同时连接两个完全相同的抗免疫球蛋白E分子。在我们的夹心法免疫检测中，存在于样品中的免疫球蛋白E能跟抗免疫球蛋白E抗体发生反应，那些抗免疫球蛋白E抗体吸收在检测器表面，能用ZnSe纳米晶体标记的相同的抗免疫球蛋白E抗体进行检测。图5显示了用阳离子交换信号放大检测人免疫球蛋白E的标准曲线。线性检测范围可达100 ng/mL，荧光持续增加当免疫球蛋白E达到饱和时荧光信号超过1 g/mL（如图5中插入图所示）。跟使用放射性同位素标记法相比43，这种方法的检测限可达1ng/mL。这种以阳离子交换信号放大为基础的检测方法能够用于纯净人血清中免疫球蛋白E和一系列血清稀释物（使用1 PBS缓冲溶液稀释）的检测。稀释的血清包含更低量的蛋白质，其中的量化结果可能很少受到背景中非特异性结合蛋白质的影响。事实上，每一种由标准免疫球蛋白E检测曲线得到的血清溶液中免疫球蛋白E的浓度会随着稀释溶液中血清的体积比而逐渐增加。然而，血清比例低于30%的缓冲溶液的增加斜率显然比高血清比例高的缓冲溶液的增加斜率大（如图6所示），这包括了背景蛋白质中更高蛋白质的含量可以降低对免疫球蛋白E的检测能力。检测平板上相关蛋白质对抗免疫球蛋白E抗体的非特异性结合可以阻止免疫球蛋白E的捕获和降低最终的检测信号。具有较高血清稀释因素，如像9%-33%这样更低的血清含量百分比，我们计算出来的免疫球蛋白E的浓度始终在261.1 15.8 ng/mL，这显然是成年人血浆中一个合理的水平。44Figure 6. Calculated IgE concentration in human serum dilutions with 1 PBS plotted against the serum volume percentage. The dilution fold was 1-, 2-, 3-, 5-, and 10-fold, respectively. IgE in serum with or without dilution was tested with ZnSe CXAmp, and the concentration of IgE was calculated based on the standard curve. 阳离子交换信号放大信号强灵敏度高，使利用高稀释血清降低大量基体蛋白质的影响成为可能。因为可以应用更多特异性捕获剂和报道分子，所以能够实现对免疫球蛋白E的更精确测量。而且在我们的夹心法测量中，每一个免疫球蛋白E分子都键合了两个完全相同的免疫球蛋白E抗体。通过免疫球蛋白E的变形来进行相互结合，这样会增加分子内部的张力。45对结合位点的竞争和结构变形的阻止都能够降低检测的灵敏度。可以预期，使用两种类型的抗免疫球蛋白E来识别免疫球蛋白E分子的不同抗原位点能够提高检测的灵敏度。人免疫球蛋白E的几种单克隆抗体和特殊的核酸适合体已经制造出来，46-48它们可以很容易地和具有强大信号策略的阳离子交换信号放大法结合使用，这样在免疫球蛋白E检测中可以得到更强的特异性和更高的灵敏度。结论在最近的研究中对阳离子交换信号放大进行了的一些技术上改进。水环境中合成的具有生物相容性的ZnSe纳米晶体被证明在免疫检测中同阳离子交换信号放大结合用于信号处理具有很好的稳定性。和传统标记物包括荧光染料、量子点和生物酶相比，ZnSe纳米晶体阳离子交换信号放大获得更高的灵敏度和更低的检测限。它的检测能力在检测人血清中免疫球蛋白E的过程中得到了很好的体现。当前的发展也指出使用不同类型的纳米晶体用于阳离子交换进行信号放大可以满足不同的实验要求。然而，为了提高阳离子交换信号放大法操作简单、实现高信号和得到高灵敏度，我们还有很多工作要做。例如，可以开发出一种更稳定的纳米晶体用于不同的样品基底和纳米晶体的簇能够够释放出更强的信号放大功能。阳离子交换和荧光触发过程能更进一步地简化从而适用于不同的检测平台。阳离子交换信号放大中的背景问题源于金属相应染料的自发荧光，可以使用键合澜系元素标记和时间选通数据征用技术加以解决。49致谢这项工作的启动资金是由加州大学滨河分校的Zhong先生提供的。非常感谢Le He，Tao Wu两位先生提供投射电子显微镜和X射线衍射协助我们进行检测。提供的支持信息文中标记的附加信息。这些信息通过因特网免费提供.参考文献：(1) Gauglitz, G. 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