大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案.doc

鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品肝、脾触片革兰氏染色镜检普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养革兰氏染色镜检、生化实验鉴定普通肉汤培养基增殖培养药敏实验。1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4冰箱待检。2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.30.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.20.2。），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.20.2）。22 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。2.2.3再加95%酒精脱色，作用1530s，水洗；加番红复染液复染1min，水洗，自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。结果鉴定：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。可见革兰氏阴性,两端钝圆、无芽胞、单个散在的短杆菌。2.3 菌的分离培养以无菌操作的方法，将灭菌后的外科手术刀片烧烙脏器被膜后，再用接种环刺入脏器实质取样做分离培养。分别接种在普通琼脂平板和麦康凯琼脂平板，37恒温培养24h，然后观察，同时进行革兰氏染色镜检。结果鉴定：在普通琼脂平板上生长菌落较为一致,直径2 mm左右,菌落呈圆形、凸起、湿润、半透明、灰白色;在麦康凯平板上生长出红色、中等大小、圆形的菌落。2.4 革兰氏染色镜检 用接种环挑取一环生理盐水蘸于洁净玻片上，再用接种环挑取少量麦康凯琼脂平板上培养2O h的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约1530s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果鉴定：经镜检可见到呈红色的革兰氏阴性菌，两端钝圆，短小杆菌，偶有23个菌体相连，无芽孢。2.5 生化鉴定a、糖发酵试验 取可疑菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖发酵管，37培养23d，观察各管产酸产气情况。 b、甲基红（MR）试验 取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37培养23d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果，红色者为阳性，黄色者为阴性。c吲哚试验 取可疑菌接种至蛋白胨水培养基中，37培养23d。先加入3-4滴乙醚，塞紧棉塞振摇试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置试管架上片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂23滴，在接触面呈红色者即为阳性反应。dVP试验 取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37培养23d，加入VP指示剂，混匀后观察结果，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。结果鉴定：a.糖发酵试验，大肠杆菌能利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，而蔗糖则不被利用。 b.甲基红试验：阳性。 c.吲哚试验：阳性。 d.VP试验：阴性。2.6 菌的增殖培养挑取普通琼脂平板中表面生长光滑、边缘整齐、灰白色、半透明的单个微隆起小菌落，划线接种于普通肉汤中，在37恒温培养24h5。结果鉴定：肉汤呈均匀浑浊，管底有灰白色沉淀，并有粪臭味。3 药敏实验3.1 准备材料：测试药、生理盐水、滤纸、青霉素空瓶、酒精灯、接种环。普通琼脂平板培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.30.1）、平皿、超净台、恒温箱。3.2 药敏片的制备3.2.1药液的制备：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。 3.2.2 纸片的制备：取滤纸，用打孔机打成圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37烘箱中数天，使完全干燥。 3.2.3抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。 3.3 药敏实验在无菌条件下将培养24h的肉汤培养物，用灭菌生理盐水作10倍稀释，取0.2mL滴加在普通琼脂平板培养基上，用灭菌棒涂匀，平板置室温下干燥35min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，等距离放置