蚕豆根尖微核检测技术.doc

遗传学综合实验蚕豆根尖微核检测技术班 级：08级 生物技术一班组 员：杜文杰 赵孙平 夏乔莉 龚思慧 杨明慧指导老师：颜老师 宋老师实验时间：2010.11.29 2010.12.6目录【摘要】本实验是通过对蚕豆根尖微核百分率的测定来判断处理液对蚕豆生长的影响程度。处理液分别为CrO3 ，NaN3 ，武大东分九曲河污水和寝室只来水；CrO3和NaN3 设计了三个浓度梯度分别为0.01 mmol/L，0.02 mmol/L 和0.05 mmol/L，污水直接采用原液对蚕豆根尖进行处理，自来水作为空白对照，通过测定微核率，来判断其对蚕豆的诱变能力。实验结果证明CrO3和NaN3对蚕豆的诱变能力均较大，九曲河的水质污染较严重。 【关键字】蚕豆 微核 CrO3 NaN3 污水 自来水 微核率 污染指数1前言1.1 背景及应用蚕豆根尖细胞微核试验(micronucleus test，MCNT)是一种以蚕豆根尖细胞微核出现的频率为测试终点的植物微核监测方法【1】。细胞微核的出现由于环境污染物(如物理、化学、生物污染源)能诱发植物细胞的染色体畸变，染色体断片游离在细胞质中于分裂末期形成微核。细胞微核技术是一种灵敏度高、操作技术简单的用于监测环境致突变物的诱变活性对人体和其他生物体遗传物质产生危害的技术，并从细胞遗传学水平上探讨植物遗传物质的改变状况与环境污染程度的相互关系【23】。我国在1985年开始研究应用蚕豆根尖微核技术直接监测淡水湖泊的水质情况【4】，该项技术被广泛应用于对淡水河流、湖泊、地下水及工业污水的水质研究，并形成了规范化、标准化的实验操作方法和微核识别标准，我国国家环保局已将其列入我国水环境监测技术规范【5】。由于大量新化合物的合成、原子能应用、各种各样工业废物的排除，是人们需要有一套高度灵敏、技术简单的测试系统来监视环境的变化。真核的测试系统更能直接推测诱变物质对人们或其它高等生物的遗传危害，微核测试是一种比较理想的方法，有研究显示用植物进行微核测试与用动物进行微核测试的一致率可达99以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断各方面。【6】采用高等植物花粉孢子利用其天然的同步性做微核测试材料，取得较好效果，其中70年代末Te-Hsiu Ma 用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa），建立的四分孢子期微核率计数（MCN-in-tetrad）的测试系统是较好的系统之一。华中师范大学生物系自1983年开始，建立了一套蚕豆根尖微核测试，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家生物监测技术规范（水环境部分）【7】近年来，蚕豆微核试验被广泛应用于环境污染，辐射损伤，化学诱变剂等的监测。我国在1985年开始研究应用蚕豆根尖微核技术直接监测淡水湖泊的水质情况7-8。因而，诱变物污染状况的研究对环境整治有非常重要的现实意义。1.2 目的1.了解细胞微核形成的机理及其形态特点；2.了解染色体畸变的各种类型、为何测试的原理和病理遗传学在实际生活和工作中的应用范围及意义；3.学习蚕豆根尖的微核检测技术。1.3 原理微核（micronucleus，MCN）是真核生物细胞中的一种异常结构，一般认为它是由有丝分裂后期丧失着丝粒染色体断片产生，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核以外的核块。当细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核以外的小核（大小在主核直径1/3以下），及形成了微核。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一致，也具有合成DNA的能力。虽然在正常的细胞中也可观察到微核，但各种理化因子，如辐射、化学药剂往往使一些细胞中产生微核。已经证实，微核率的高低与作用因子的剂量或辐射积累效应呈正相关。【8】来自外界的各种理化因子对集体会产生不同的影响。有的会引起染色体的损伤，如微核，染色体桥，染色体片段，染色体环等。本实验利用环境污水及药物处理对蚕豆根尖细胞，可观察到上述现象。2. 材料与方法2.1 材料蚕豆，一次性杯子，牙签，绳子，纱布，封口膜，橡皮筋，量筒，烧杯，移液管，洗耳球，载玻片，盖玻片，擦镜纸，显微镜6 mol/L 盐酸，甲醇，冰醋酸，石炭酸，95乙醇，1 mol/L CrO3，NaN3粉末，东分九曲河污水，蒸馏水2.2 方法2.2.1 浸种催芽将晒干的蚕豆种子40颗放入盛有自来水的容器中，室温（大约18）下浸泡，待其吸胀有一点芽冒出后，选出发芽良好的蚕豆种子用线穿起来，悬挂，使其下端浸没在水中（如图2-1）。图2-1放入25 恒温培养箱中进行催芽。经过18 h （11.29 16：0011.30 10：00）换水一次，继续催芽6 h（11.30 10：0011.30 16：00）。大部分初生根长至12 cm 。2.2.2 处理蚕豆根尖1. 制作培养装置。如图（2-2）图2-22. 配置处理液0.01 mmol/L CrO3，0.02 mmol/L CrO3，0.05 mmol/L CrO3。取1 mol/L CrO3 10 l ，溶解于200 ml蒸馏水中，得到0.05 mmol/L CrO3溶液200 ml。取0.05 mmol/L CrO3溶液20 ml +80 ml 的蒸馏水得到0.01 mmol/L CrO3溶液。取0.05 mmol/L CrO3溶液40 ml +60 ml 的蒸馏水得到0.02 mmol/L CrO3溶液。0.01 mmol/L NaN3，0.02 mmol/L NaN3，0.05 mmol/L NaN3。用分析天平称取0.1625 g NaN3粉末，溶解于500 ml 蒸馏水中，得到5 mmol/L的NaN3 溶液。取5 mmol/L的NaN3 溶液2 ml，稀释100倍，得到0.05 mmol/L的NaN3 溶液200 ml。取0.05 mmol/L的NaN3 溶液20 ml +80 ml 的蒸馏水得到0.01 mmol/L NaN3溶液。取0.05 mmol/L NaN3 溶液40 ml +60 ml 的蒸馏水得到0.02 mmol/L NaN3溶液。污水，直接从武汉大学东湖分校九曲河中取污水一杯。自来水处理3. 处理将蚕豆分别放入8 种处理液中，尽量使同一处理液中的蚕豆长势接近，每种处理液中放4 颗，分别加入处理液浸没根尖即可（如图2-3，2-3，2-3）。杯口用纱布盖住，以防处理液蒸发太快。将培养杯放入25 恒温培养箱中进行处理24 h（11.30 16：0012.1 16：00）。图2-3图2-4图2-52.2.3 恢复培养倒掉处理液，分别用自来水浸洗3次，每次3 min。在加入自来水浸没根尖即可，放入25 恒温培养箱中进行恢复培养20 h（12.1 16：3012.2 12：30 ），换水一次继续培养（12.1 12：3012.2 15：00）。2.2.4 固定倒掉恢复液，将根尖12 cm剪下。按照甲醇：冰醋酸=3:1 配置卡诺固定液。将根尖分别在原杯中进行固定（12.2 15：0012.3 15：00）。2.2.5 保存倒掉固定液，用 95 的乙醇配置 70% 的乙醇100 ml ，分别浸没根尖。置于4 冰箱中保存。2.2.6 酸解用蒸馏浸洗固定好的幼根2次，每次5 min ，吸净蒸馏水，加入6 mol/L 盐酸将幼根浸没，室温酸解10 min ，幼根软化即可。2.2.2 染色观察吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1.5 min 。最后浸没于水中，制片前取出置于载玻片上，截下12 mm 长的根尖，滴一滴石炭酸品红染液，染色6 min ，加一盖玻片，压片观察。3. 结果与讨论3.1 固定后的根尖 （如图3-1）图3-1随着处理浓度增大，蚕豆根部颜色逐渐由乳白色逐渐转变为浅黄色、黄色、褐色甚至变成黑色。同时还发现蚕豆根尖产生不同程度弯曲，硬化。【9】分别为三个不同浓度处理的根尖固定后的形态，颜色并没有明显的渐进趋势，但是还是可以看出的颜色较深，形态较弯曲；分别为三个不同浓度处理的根尖固定后的形态，可以看到明显的颜色变化，弯曲程度也依次增大；为污水处理的根尖固定后的形态；为自来水处理的根尖固定后的形态，其颜色较更黄。在催芽过程中，有几个生长较快的根尖，错过了用处理液培养的时间，它们就被用来来做自来水的空白对照，固定后用70% 的乙醇保存放4 冰箱，比其它的根尖保存的时间长。从上图形态看，其颜色更深；在镜检压片时，发现其根尖较硬，不好压片。3.2 镜检及微核识别标准【10】（1）在主核大小的1/3 以下，并与主核分离的小核；（2）小核着色与主核相当或稍浅；（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则图形。每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中的微核数并进行记录（表3-1）表3-1镜检日期：2010/12/6处理液序号各自观察的三个根尖平均细胞数及微核数平均微核千分率污染指数结果细胞数微核数CrO39751.71.71.3无污染11287.064.6重度污染103712.311.99.2重度污染NaN310101.31.20.9无污染9942.32.31.8轻度污染10034.34.33.3中度污染污水101913.313.110.0重度污染自来水9891.31.31无污染注：MCN = N abnormal / N total*1000 污染指数 = 实测微核率 / 标准(自来水)微核率污染指数在0.5 1.5 之间表示无污染；在1.51 2.0 之间表示轻度污染；在2.01 3.5之间表示中度污染；在3.5以上表示重度污染。3.3 讨论 从以上的实验结果及分析可看到，各种处理均能使蚕豆根尖细胞产生微核，但各个处理的具体结果是不相同的，CrO3和NaN3均有较强的微核诱导性，在三个浓度下的污染指数分别为1.3、4.6、9.2和0.9、1.8、3.3；在如此小的浓度下，其对蚕豆根尖影响就这么大，可想而知其原液的毒性有多大。武汉大学东湖分校九曲河的污染指数为10.0，水质污染情况是较严重。可能是由于那是一条死水，学校相关部门又没有给与重视。作为空白对照的自来水中也检测到一定数量的微核，警示我们在日常生活用水中也要注意，不能直接饮用自来水。在镜检的过程中发现有大量的细胞呈长梭形，细胞分裂受到抑制。实验心得体会 本次实验还算比较顺利，也从中学到了不少东西。从最初的不知道从何开始，通过查资料，到一步步的实验。主要总结出以下几点：第一，蚕豆要根据情况酌情多泡，以便于在催芽后选出生长长度接近的进行同一处理；蚕豆个体之间存在差异，可能会出现有的蚕豆的芽都长1cm 了，有的却还没有发芽。第二，温度对蚕豆芽的生长有很大影响，第三，要控制好处理液的浓度，我们两种处理液都是采用的0.01 mmol/L ，0.02 mmol/L 和0.05 mmol/L 三个浓度梯度，检测出来的微核率还算比较理想。第四，在催芽、处理和恢复的过程中，要注意换液。我们的微核率相对于其他组平行的实验有点偏高，可能是由于在恢复的过程中，我们没有换水，使得本来可以通过恢复而消失的微核没有消失，微核明显增多，没有真正达到恢复的目的。第五，镜检过程中，压片时要用力。植物细胞的压片相对与动物细胞来说较难，容易出现细胞堆积的现象，不是所有的细胞都在同一平面上，影响镜检结果。参考文献【1】 MA THVicia faba cytogenetic test for environmental mutagena report of the USEnvironmental Protection Agency Gene-Tox ProgramJMutat Res,1982，99：257271【2】 Fenech M, Chang WP, Kirsch-Volders M, et al; HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte culturesJ.Mutat Res, 2003, 534(1/2):6575.【3】 Kirsch-Volders M, Fenech M. Inclusion of micronuclei in non-divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for biomonitoring purposesJ. Mutagenesis, 2001, 16(1):5158.【4】 王跃华,马丹炜,陈小军,等.用蚕豆根尖细胞微核技术监测府