大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定.doc

大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定【关键词】 胚胎【摘要】 目的：探讨胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定方法。方法：原代培养、培养细胞生长状况观察、组织化学鉴定、流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：准确分离出了神经干细胞，了解其生长规律及细胞凋亡的情况。结论：用此方法分离胚胎神经干细胞实用、便捷和可行。【关键词】 大鼠;胚胎;神经干细胞Extraction、Culture and Appraisal of the Rat Embryo Neural Stem CellsJI Shengpu,WEI Huiping Hebei North University，Zhangjiakou， 075000， China【ABSTRACT】 Objective:To master extraction、culture and appraisal of the rat embryo neural stem cells initially by experiment,In this paper the growth rule and apoptosis of embryo neural stem cells were studied.Methods:the growth cycle and growth state for primary culture neural stem cells were observed carefully,and apoptosis was analyzed with histochemistry identitication and FCM(flow cytometry) as well.Results:investigated thororghly The neural stem cells were abstracted accurately, and their development cycle and apoptosis condition were investigated thoroughly.Conclusion:The result above can provide reliable evidence to obtain a great quantity of neural stem cells.【KEY WORDS】 rat;embryo;neural stem cells干细胞具有可再生为各种组织、器官的潜能，将其分离并使之向特定方向分化，就可以用健康组织代替病变组织，治疗心肌梗死、糖尿病等组织坏死性疾病、退行性病变、自体免疫性疾病等。神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是具有增殖和分化潜能的原始神经细胞，它能分化成神经组织的各种细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，并能自我更新，甚至能终身存在于神经系统之中。NSCs在理论和临床上都具有巨大的价值，我们知道，脑老化可能是神经系统退变性疾病的初级阶段，与疾病的发生有着相同的基础，目前已用NSCs治疗神经系统退变性疾病，并且也用于脑老化的治疗。为此我们需要大量的神经干细胞，本课题选取大鼠胚胎神经干细胞，探讨其分离、培养、鉴定的方法，并探讨其体外生长的生物学特性。1 材料和方法1.1 材料 培养基：小牛血清，天津生物制品研究所；DMEM/F12培养基；EGF、bFGF、辅助培养基等均购自北京试剂商店。实验动物：20d大鼠胚胎，由河北北方学院动物中心提供。1.2 方法原代培养 取材：在无菌室内取孕鼠新鲜子宫，用烧杯盛之，用75%酒精浸泡，严格无菌的条件下，取出胚胎，剪开头皮，撕去脑膜，掀开大脑皮层，分别取侧脑室部位和大脑皮层脑组织，用Hanks液反复冲洗，去掉血液和血块，除尽脑膜组织和结缔组织。分离细胞：将组织移入青霉素小瓶，剪碎脑组织，加入025%胰蛋白酶37度消化15min，然后加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用200目不锈钢筛网过筛，获得单细胞悬液，然后离心，获细胞沉淀（1000转/min，8min）。细胞培养：在细胞沉淀内加入1ml含小牛血清的培养基，吹打均匀，制成细胞悬液。取出一滴细胞悬液，细胞计数板计数，然后以35万/ml细胞接种到25ml培养瓶中，37，5%二氧化碳，95%湿度孵箱培养。24h后除去贴壁的分化细胞和沉淀杂质。分为两组：一组加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基；另一组换为新鲜无血清胚胎神经干细胞培养基，其组分为：DMEM/F12，20ng/ml EGF,20ng/ml bFGF，辅助培养基。培养后视培养基颜色和细胞生长状况进行稀释和换液。培养细胞生长状况观察 每天对细胞进行计数，随即选择10个高倍视野，取其平均值，作为每天的细胞数目指标，由此可知细胞的生长状况。每天对细胞的形态、分裂、分化情况、有无克隆球等生物学特征进行观察，记录结果。2005年6月河北北方学院学报（医学版）第3期2005年6月吉胜朴等：大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定第3期组织化学鉴定 原代培养次日换液时，取一瓶培养细胞，吹打均匀后离心，去上清液，滴加05ml细胞因子培养基，吹打均匀，直接滴加在025%多聚赖氨酸包被好的盖玻片上，进行培养，生长5d后，终止培养，按常规免疫荧光方法进行鉴定，鉴定未诱导分化的神经球的细胞属性。流式细胞仪进行细胞凋亡分析 自原代培养当天起，每隔23d取一瓶细胞，4%多聚甲醛固定，用于细胞凋亡分析。2 结果2.1 培养细胞的生长情况 原代培养细胞均为圆形亮球状，含小牛血清培养基中的细胞第三天开始贴壁分化，细胞渐渐变为梭形，伸出突起，第6天出现大量神经元和神经胶质样细胞，突起交织成网状。培养物中共有四种不同形态的细胞：悬浮圆形亮球状神经干细胞样细胞；具有12个长突起的神经元样细胞；多个细突起且不断分支的少突胶质细胞样细胞；多个粗长突起的星形胶质细胞样细胞。含生长因子的培养基中细胞大多为圆形亮球状，于第3天可见正在分裂细胞，并在第4天可见神经球；但含生长因子的培养基中也有贴壁分化伸出突起的细胞，这些细胞活力渐渐减小，于第5天完全凋亡。2.2 生长曲线 原代培养细胞接种密度为35万/ml，在倒置相差显微镜下随机选择10个高倍视野计数（1020倍），若平均每个视野细胞数为350计算，由此可知，每视野1个细胞所代表的实际瓶中细胞密度为350000/350=1000/ml。当第二天观察到每视野平均数为80时，就知道实际瓶中细胞浓度为801000/ml。经每天计数发现，生长因子组培养25d细胞数量有明显下降，可见细胞大量死亡。68d细胞数量成指数增加，9d后细胞增加趋于平缓有受抑制现象。血清培养基一直呈平缓下降趋势,见表1。表1 两种培养基不同时间的细胞数（略）2.3 免疫荧光结果 nestin是一种中间纤维骨架蛋白，可以作为神经干细胞的鉴别标记。用荧光免疫组化法染色，荧光显微镜下观察，有圆球状细胞发出黄绿色荧光，背景呈深绿色；而血清对照组则无此现象，但可以看到胶质细胞样细胞的形态轮廓，荧光相对很弱。这说明观察的圆球状细胞可能是神经干细胞。2.4 用流式细胞仪检测细胞凋亡率 细胞凋亡率见表2，培养第一天细胞凋亡率只有13%，而细胞密度却从35万下降到第二天的24万。表2 细胞凋亡率（略） 3 讨论3.1 神经干细胞的分布 神经干细胞是一类可自我更新、具有分化潜能的原始细胞类型。就神经干细胞的来源而言，目前大多数学者主张室管膜或室管膜下层是中枢神经系统各个部位干细胞的来源，其他部位尽管存在着有分裂能力的细胞，但这些细胞被认为是室管膜或室管膜下层的神经干细胞经过某种途径迁徙而来的。这些细胞严格来说已经不是干细胞了，因此他们的增殖能力是有限的。3.2 细胞分离方法 分离细胞时我们采用了不同于常规的胰酶消化法，即再回收筛网上的脑组织加入025%胰蛋白酶37消化15min，然后加入含10%小牛血清的DMED/F12培养基终止消化，用200目不锈钢筛过筛，除去未分散的脑组织获得单细胞悬液。这种方法的优点是避免了过度消化或过度机械吹打造成的细胞碎片，缺点是易污染，因此操作时应特别小心。3.3 培养细胞的方法 我们在取材当日进行细胞计数，接种密度为35万，第二天细胞密度急剧下降，离心前24万，这是大量非神经干细胞死亡造成的。离心后密度9万，说明离心会造成大量细胞损失，因此，在整个培养过程中采用了半定量换液法，得到的生长曲线与其他的文献数据基本一致，所以，半定量换液法是减少神经干细胞死亡的有效措施之一。3.4 细胞生长和凋亡情况 血清培养基细胞生长一直呈下降趋势是因为分化细胞一般不会再增殖，而神经干细胞在体外保持未分化状态及其增殖特性，在培养基中加入一定浓度的促有丝分裂因子，如EGF和bFGF，经过25d的潜伏期后，68d细胞表现为对数生长期，9d后增加趋于平缓，有受抑制现象，这可能是因为体外培养条件有限，只有少部分细胞保留了干细胞的特性，其余大部分则经过非对称性分裂生成为先祖细胞，最后变成某一特定表型细胞的前体细胞，虽然细胞仍保持幼稚的特点，但并不能分裂增殖，因此生长9d后细胞增加趋于平缓，有受抑制的现象。细胞凋亡率表明：第一天细胞凋亡率只有13%，而细胞密度却从35万下降到第二天的24万，此时细胞死亡可能是由于细胞坏死和受机械损伤所致，这与形态学观察的结果一致。凋亡细胞在指数生长的第6天到第8天呈下降趋势，从846%到662%。细胞凋亡率减少意味着细胞数量增加，这与生长曲线68d呈指数生长完全吻合；第11天细胞凋亡率呈下降趋势，细胞增殖也呈下降趋势，说明11天后细胞因子对细胞增殖没有促进作用，所以生长呈现增长缓慢。流式细胞仪定量测定细胞凋亡率的结果评价：细胞固定后可长期保存，适用于不同时间获得的组织或细胞之间的比较研究，但由于先固定细胞，再进行染色，故不能将凋亡细胞与坏死细胞和受机械损伤细胞严格区分开来。参考文献1 Bjorklund A.Lindvall OJ.Nature,2000,405:8928952 Dunnett SB, Bjorklund A.Lindvall OJ.Nat Rev Neurosci,2001,2:3653693 蔡文琴，李海标主编.发育神经生物学M.北京：科学出版社，1999.2592794 杨玲鳞，李小玉，胡火