γ-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控.doc

ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书( 2005版) 第3页同行评议组别农业微生物学项目编号Y305236浙江省自然科学基金申 请 书申报类别:一般项目项目名称:-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控申 请 者:阮红电 话托单位:浙江大学城市学院通信地址:杭州市湖州街50号浙江大学城市学院生命科学分院邮政编码:310015E-mail :申报日期:2005-5-25浙江省自然科学基金委员会二OO五年制基本信息申请者信息姓 名阮红性别女出生日期1968年05月15日最终学位博士获学位年份2000职称副教授主要研究领域微生物基因代谢调控机理研究E-电 人网页 依托单位浙江大学城市学院证件类型身份证证件号请者是否近三年调入在浙单位工作是调入时间2004年08月申请者曾主持的浙江省自然科学基金资助项目编号: 申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限: 项目基本信息项目名称-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控申报类别一般项目研究属性前瞻性应用基础研究同行评议组别农业科学及生物技术/农业微生物学依托基地名称浙江省细胞与基因工程重点实验室-浙江大学预计研究年限2006年01月2007年12月总经费预算10.0万元申请经费10.0万元项目研究目标、内容和意义简介(限400字)本项目围绕2005年浙江省自然科学基金申请指南第(12)项农业资源产业生物技术研究方向中提及“食品、功能与药用物质发酵生产所需的高效工程菌”重点问题立项展开研究，意在采用基因过量表达和基因整合手段，将-聚谷氨酸生产过程中的关键合成酶复合体基因pgsBCA导入谷氨酸棒杆菌优质的谷氨酸高产菌种中，构建-聚谷氨酸高效工程菌株，以期实现谷氨酸棒杆菌中的-聚谷氨酸高效表达，寻找基因工程技术对-聚谷氨酸合成的有效调整作用。令人鼓舞的是，-聚谷氨酸高效工程菌株构建研究意向，还得到了省内氨基酸生产行业知名企业的高度关注，厂方予以大力支持并配合我们展开科研工作，并提供我们高谷氨酸产量的谷氨酸棒杆菌优质菌种协助进行科技攻关。该项目启动将是省内氨基酸生产领域的一个新的亮点，必将为省内氨基酸企业实现-聚谷氨酸发酵的产业化奠定重要基础，具有深远的理论意义和现实意义。关键词（不超过4个）-聚谷氨酸高效工程菌株;pgsBCA;谷氨酸棒杆菌同行评议分组说明微生物生理与生物化学 重点资助方向农业资源产业生物技术研究申请书版本号：88000186 项目组主要成员编号姓名出生日期性别职称学位单位名称电话项目分工每年工作时间（月）（(月)1阮红1968年05月15日女副教授博士浙江大学城市学责人72范立梅1965.05.05女副教授硕士浙江大学城市学因表达和整合63蒋立娣1968.07.24女实验员学士浙江大学城市学酵产物分析64周鹏1978.03.21男硕士生学士浙江大学生命科学学因表达和调控105李永亮1979.12.11男硕士生学士浙江大学生命科学学酵产物分析106 7 总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数52010022说明：1.个人介绍部分申请者必须填写，其他人员可以不填写；2.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生及参加单位数由申请者负责填报，总人数自动生成；3.第一人必须是申请者，信息从前面自动读入，但每年工作时间必须手工录入。ZJNSF 浙江省自然科学基金申请书（2005版） 第18页个人介绍：阮红：女，1968年出生，博士，副教授，硕士生导师。1991年山东大学微生物学专业本科毕业，1994年浙江大学植物病理学生物技术专业硕士研究生毕业后留校任教。2001年浙江大学在职博士研究生毕业。攻读博士学位期间，获德国政府DAAD奖学金“博士生联合培养计划”资助，赴德国Ulm大学进行博士论文研究工作。2002年赴美国加州大学圣地亚哥分校进修。2004年8月调入浙江大学城市学院工作， 任生物技术系执行主任。曾主持国家教育部留学回国人员启动基金项目，先后参加国家自然科学基金、国家自然科学青年基金及国家863计划资助项目的研究工作。现在主持城市学院人才基金项目“谷氨酸棒杆菌-聚谷氨酸酶复合体pgsBCA基因的克隆”。多年来，曾在国际学术刊物J Biotechnology和中国科学等国内学术刊物上发表论文18篇，其中被SCI收录3篇，12篇为第一作者。学位获得：1987-1991：山东大学微生物学系，微生物学专业学士学位。1991-1994：浙江大学生物技术研究所，植病专业生物技术方向硕士学位。1996-2001：浙江大学生物化工专业生物工程方向博士学位。在职就读浙江大学博士期间，于1999年9月至2000年12月，获德国政府DAAD奖学金“博士生联合培养计划”资助，赴德国Ulm大学微生物与生物技术系从事谷氨酸棒杆菌乙酸代谢调控机制的博士论文研究。主持科研项目：2002,12 2004,12主持国家教育部留学回国人员启动基金项目-谷氨酸棒状杆菌碳分解代谢调控蛋白基因ccpA克隆及其代谢调控机制研究（项目编号：108201-G50229，资助经额为三万元）；2004，8 - 2006，8 主持城市学院人才基金项目-谷氨酸棒杆菌-聚谷氨酸酶复合体pgsBCA基因的克隆（资助经额为六万元）主要科研论著：1.RUAN Hong, Gestmeir R, Schnick S, Eikmanns B. The amrG1 gene is involved in the activation of acetate in Corynebacterium glutamicum. The Science in China Ser.C Life Science, 2005,48(2):97-105 （SCI收录，通讯作者） 2.阮红, Gestmeir R, Schnick S, Eikmanns B. amrG1基因在谷氨酸棒杆菌乙酸活化中的作用 中国科学C辑, 2004, 34(3):223-231（SCI收录，通讯作者）3. 阮红, 宣日荣 谷氨酸棒状杆菌在乙酸代谢PTA, AK, ICL and MS酶活测定。 enzymes involved in acetate metabolism of Corynebacterium glutamicum. 浙江大学学报(农业与生命科学版) 2003,29(5):529-533.4.Gestmeir R, Wendisch V F, Schnicke S, Ruan H, Farwick M, Reinscheid D, Eikmanns B. Acetate metabolism and its regulation in Corynebacterium glutamicum. J Biotechnology, 2003, 104: 99-122 （SCI收录） 5.阮红, Eikmanns Bernhard 转座子挽救法对转座子突变菌株中插入位点的定位分析。微生物学报 2002, 42(3): 326-3306. 阮红, Eikmanns Bernhard 谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建。微生物学报2002, 42(4)：80-867. 阮红, Gestmeir Robert, Eikmanns Bernhard 谷氨酸棒状杆菌在乙酸盐和葡萄糖基质上的蓝白生长筛选. 浙江大学学报(农业与生命科学版) 2002, 28(2): 141-1468. 阮红, 吕志良 女贞子多糖免疫调节作用研究。中国中药杂志1999, 24（11）：691-6939.许学伟, 吴敏, 阮红, 黄伟达, 迪丽拜尔托乎提 一个新的Br蛋白基因部分序列测定及分析. 遗传, 2004, 26(3): 343-348。10.许学伟, 吴敏, 阮红, 洪吉, 黄伟达 嗜盐古生菌AJ4中BR蛋白基因部分片段和16srRNA基因序列研究。中国生物化学与分子生物学报, 2004, 20(1):55-60 申请经费预算 10.0 万元 计划开支项目名称计算根据及理由金额（万元）1信息费文献检索,资料复印,版面费0.22专题学术活动费参加学术会议和科研交流0.43仪器和设备购置费试剂/药品购置；玻璃器皿和实验室易耗品7.04能源材料费材料购置,实验室维持0.55计划管理费按学校规定0.46人员费课题组成员劳务费1.5注：开支范围和标准参见浙江省省级科技项目经费管理暂行办法（浙财教字200220号）。 申请者承诺：我保证： （1）申请书内容是真实的；（2）恪守科学道德，伦理道德的基本原则；（3）项目组成员知晓申请书内容，并自愿参与研究工作；（4）已如实填报申请者正在主持的国家和省部资助经费在20万元及以上的研究项目名称、来源和研究期限；（5）如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守浙江省自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实或违反规定，本人将承担全部责任。 签字： 日期：项目依托单位承诺:已按规定对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守浙江省自然科学基金委员会有关规定，督促项目组遵守科学道德和伦理道德的基本原则，督促项目负责人和本单位项目管理部门按照规定及时报送有关材料。依托单位公章 日期 .项目：-聚谷氨酸高效工程菌株的构建和代谢调控 性质：一般项目1、项目研究意义本项目申请与2005年浙江省自然科学基金申请指南第(12)项农业资源产业生物技术研究方向中提及“食品、功能与药用物质发酵生产所需的高效工程菌”重点问题研究基本吻合。-聚谷氨酸（Poly -glutamic acid，-PGA）是由D-谷氨酸或L-谷氨酸的-羧基与氨基通过酰胺键连接聚合而成的均氨基酸化合物，分子量在11051107道尔顿范围内。作为一种生物高分子材料，-PGA具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点，可广泛应用于食品包装到一次性餐具使用；-PGA又具有极佳的高吸水性和保湿性, 可增强人体对维生素及矿物质的吸收, 用于医药、化妆品、功能保健食品和饮料产业；-PGA还有抗菌抗氧化等污水处理功效1-4。虽然目前-PGA的市场需求和销售前景十分可观，但浙江省乃至国内的-PGA规模化生产尚在酝酿中。近来国内外主要选用以枯草芽孢杆菌为代表的微生物发酵法来生产-PGA。早在1937年由Ivanovics5 首先在Bacillus anthracis的荚膜中发现了-PGA，此后微生物发酵法生产-PGA有了一些尝试性研究。特别是二十世纪九十年代后，在分离筛选以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis为代表的-PGA高产菌株方面做了大量的科学实验。Kubota从土壤中分离得到的一株Bacillus subtilis F201，该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量6，该菌株已被Meiji Seika Kaisha公司成功用于工业化大规模生产-PGA。Ogawa对 Bacillus subtilis MR 141进行培养条件优化，在30L的发酵罐中可使-PGA最大产量达到35g/L7。Yoon对Bacillus licheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，在2.5升发酵罐中发酵35小时后达到39g/L的最终产量8。国内有研究报道在适量谷氨酸供给条件下，取得产量达2030g/L,有望成为生产用株。在筛选优质菌株的工作基础上，近年来大量研究工作围绕-PGA合成酶复合体的研究展开，特别是在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中积累了一些科研成果9-16。Ashiuchi 等科学家研究发现，Bacillus subtilis中-PGA合成焦点为-PGA合成酶（Poly -glutamate synthetase，简称-PGS）复合体，其中该酶复合体（PgsBCA）有三种酶组分PgsB、 PgsC 和PgsA构成，它们分别由pgsB、pgsA和pgsC三个酶基因负责编码，开读框大小为1116bp、1155bp和450bp。结合三个酶组分的疏水氨基酸区域的研究发现以及各个基因突变的组合实验证实: 酶组分PgsA负责-PGA合成后的跨膜转运；酶组分PgsB为重要的-酰胺连接酶，用于连接形成多聚谷氨酸-PGA， 分析认为该酶还具有谷氨酸依赖的ATP水解酶特征；酶组分PgsC是与PgsB相关的蛋白，功能尚不十分清楚。尽管目前在-PGA的发酵生产方面取得了较大的进展，但在发酵生产过程中发现，-PGA合成中关键酶(PgsB, 即-酰胺连接酶)的活性需要依赖于谷氨酸，生产时需要不时地给发酵液添加谷氨酸。因此，高效低成本生产-PGA仍有待于进一步研究。如何降低谷氨酸添加成本，不妨考虑利用谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌17-21进行生产-PGA尝试。本实验室已从枯草芽孢杆菌染色体中筛选到负责-PGA合成的酶复合体三种酶组分基因（pgsB、pgsA和pgsC），并在大肠杆菌中分别进行了克隆。本项目意在采用基因过量表达和基因整合技术，将-聚谷氨酸生产过程中的关键合成酶复合体基因pgsBCA导入谷氨酸棒杆菌优质的谷氨酸高产菌种中，构建-聚谷氨酸高效工程菌株，以期实现谷氨酸棒杆菌中的-PGA高效表达，寻找基因工程技术对-PGA合成的有效调整作用。令人鼓舞的是，-PGA高效工程菌株构建研究意向，还得到了省内氨基酸生产行业知名企业的高度关注，厂方予以大力支持并配合我们展开科研工作，并提供我们高谷氨酸产量的谷氨酸棒杆菌优质菌种协助进行科技攻关。该项目启动将是省内氨基酸生产领域的一个新的亮点，必将为省内氨基酸企业实现-PGA发酵的产业化奠定重要基础，具有深远的理论意义和现实意义。2、项目研究目标及与申请者研究工作长期目标的关系研究目标：在谷氨酸棒杆菌中建立-PGA合成酶复合体PgsBCA基因表达体系，实现-聚谷氨酸高效工程菌株的构建；获取参与-PGA合成酶基因表达调控的相关基因信息。与申请者研究工作长期目标的关系：我们近几年来一直在谷氨酸棒杆菌方面开展大量的科研工作, 并与德国科研机构建立了长期的科研协作关系。该项目研究工作的开展, 是以往工作经验的运用和发挥, 有助于实现-聚谷氨酸高效工程菌株的构建。今后我们将不断关注企业的需要，和企业携手进行新产品开发，而且还将继续致力于谷氨酸棒杆菌代谢调控理论研究，提升该系统的综合研究实力，确保其达到新的科技高度，这些是我们实验室的长期目标。3、项目研究内容，研究方案和进度安排研究内容1） 以现有实验室保存菌株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC-13032、res 167和省内氨基酸生产厂家提供的高产菌为系列出发菌株, 构建三个酶基因pgsB、pgsA和pgsC的系列重组表达载体，选取pgsBAC、pgsBA、pgsAC和pgsBC等不同基因组合体，然后在谷氨酸棒杆菌中建立基因过量表达体系和基因整合体系，比较分析基因表达产物，构建-聚谷氨酸高效工程菌株，以实现-PGA合成酶复合体酶活性稳定高表达和-PGA高产合成。2） 引入转座子插入突变技术进行大规模-PGA异常代谢的插入突变菌株的筛选。采用转座子挽救法对-PGA的插入突变菌株的转座子插入位点进行定位分析, 获取一组目标基因信息，从而获取合成途径中可能起激活或阻遏作用的调控因子的相关基因信息，探讨谷氨酸棒杆菌-PGA高效合成的代谢调控机理。本项目按以下方案和技术路线实施二 -聚谷氨酸合成代谢调控机理研究一 -聚谷氨酸高效工程菌株构建 高产谷氨酸棒杆菌培养，构建pgsBCA基因重组表达载体，建立基因过量表达体系建立突变生长检测系统，筛选插入突变菌株表达菌株酶学特征比较和产物分析，获知pgsBCA基因三个组分在-聚谷氨酸合成中的作用转座子挽救法定位分析，寻找插入位点处的目标基因序列采用基因整合技术引入多个pgsBCA基因至谷氨酸棒杆菌染色体上，构建基因稳定表达菌株寻找涉及-聚谷氨酸合成酶基因表达的调控蛋白基因信息-聚谷氨酸产物分析和理化性质鉴定，以筛选-聚谷氨酸合成高效工程菌株主要实验手段和方法1） 菌种培养采用luria Bertani (LB) 培养基作为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为常规培养基(Sambrook,1989); 谷氨酸棒杆菌基本培养基成分参见Eikmanns 方法(1991, App. Microbiol. Biochem, 34,612-617) 。常规发酵培养基基本成分(可适当添加谷氨酸等其他成分)：葡萄糖110，蛋白胨28， MgSO4 0.050.5%，NaCl 18%，K2HPO4 0.010.05，pH69，装液量20200ml/500ml摇瓶，115121灭菌1530分钟，灭菌结束后，冷却，接种，接种量为110，2040摇瓶培养，转速100400rpm，在上述条件下进行摇瓶发酵实验，培养2472小时，测定-聚谷氨酸的产量。 2） -聚谷氨酸合成酶复合体三个组分基因克隆采用PCR扩增手段，参照文献方法10-12，以本实验室保存的枯草芽孢杆菌菌种中提取的染色体DNA为模板，设计上下游引物片段（PPGSB-NF2和PPGSB-CR）扩增出1.2kb大小的pgsB基因片段；采用PPGSC-NF和PPGSC-CR2上下游引物片段扩增出1.4kb大小的pgsC基因片段； 同样PPGSA-NF和PPGSB-CR2上下游引物片段扩增出0.45kb大小的pgsA基因片段。对这些基因片段经酶切割后连接至克隆载体中，转化大肠杆菌保存，并测定DNA序列。3） 基因过量表达菌株建立 选取实验室现有的保存质粒：大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭质粒（pXNJ19、pEK0、pEK EX1、pEK EX2）等为表达载体。参照文献29,30将三个酶基因组分通过酶切连接后产生基因重组片段pgsBAC、pgsBA、pgsAC和pgsBC等，然后在谷氨酸棒杆菌中分别建立这些基因重组片段的过量表达载体。各个基因组合可经诱导表达、产物分析来确定其功能。4） 基因整合菌株建立参照文献方法17-19,29,30 ，首先根据谷氨酸棒杆菌基因库DNA序列特征，设计基因整合的靶位点。待整合的目标基因片段经EcoRI酶切后克隆到含有KmR的基因取代载体pK19mobsacB 中, 在E. coli DH5中构建重组质粒。 采用基因重组交换技术, 将已克隆的重组质粒通过高效电激转化, 分别导入谷氨酸棒杆菌中进行DNA重组; 载体含有KmR基因。在含卡那霉素的培养基进行初次筛选以获得第一次重组, 即载体DNA在谷氨酸棒杆菌染色体上的定点整合; 由于载体又含有sacB基因, 不能使菌体在含10% 蔗糖的基质上生长, 因此以蔗糖为基质进行再次筛选可排除载体DNA, 载体与染色体DNA发生第二次重组, 并不再具有卡那霉素抗性; 其中再重组结果将因重组位点的差异而不同, 通过PCR方法和Southern 杂交法可确定基因整合情况。5） 转座子插入突变菌株筛选 将含转座子Tn5531和卡那霉素抗性的质粒pCGL0040通过电激转化方法导入事先构建好的蓝白斑生长检测菌株，以谷氨酸棒杆菌野生型为对照菌株, 在四环素和卡那霉素双抗平板上筛选双抗转化子, 然后将双抗转化子进行蓝白斑生长检测诱导，并将蓝白斑显示不同于原始菌株的可疑菌株进一步-PGA成分分析, 筛选-PGA产量异常的菌株为插入突变的目标菌株。6） 转座子挽救法定位分析转座子插入位点 对已筛选到的-PGA合成目标突变株, 通过其转座子及插入位点附近的序列的克隆分离, 进一步测定插入位点相邻DNA序列, 可获得转座子插入位点处的DNA序列, 从而达到转座子插入位点处目标基因的精确定位。由于本实验转座子基因两侧具有EcoRI 和 XbaI酶切位点, 可将筛选到的转座子突变菌株进行染色体 DNA分离 并且将之分别进行EcoRI 和 XbaI酶切, 回收各自的酶切片段克隆至带有AmpR 抗性标记的pUC18载体中, 转化E. coli DH5, 在含有50mg/ml那霉素 和50mg/ml氨苄青霉素的双抗筛选培养基上选择转化子, 对EcoRI 酶切片段克隆转化子以及XbaI 酶切片段克隆的转化子进行质粒的检测。检测插入片段大小和方向, 挑不同转化子, 抽提质粒后以Tn5531序列设计的引物 TnEco (5-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3)和 TnXba (5-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3) 进行DNA序列测定, 与谷氨酸棒杆菌基因库的序列进行比较分析获得插入位点序列，即目标基因序列。7） -聚谷氨酸合成酶成分提取和酶活性分析 -聚谷氨酸合成酶成分提取：参照文献进行10-12。基因表达菌株在30C 下诱导表达4-8小时后，将培养液8000g离心30分钟后收集细胞沉淀并取上清。上清中加入70%硫酸铵沉淀，12000g高速离心1小时获得酶蛋白沉淀，将沉淀溶于含有甘油和二硫苏糖醇成分的Tris-HCl缓冲液中，4C透析过夜收集胞外酶组分；细胞沉淀悬浮于缓冲液并进行4C超声波粉碎，然后将上清液进行12000g高速离心1小时和56000g超速离心30分钟的分步沉淀后收集上清，上清为胞质可溶性酶组分，沉淀悬浮于缓冲液中获得细胞膜成分中的酶组分。 -聚谷氨酸合成酶活性分析：根据-聚谷氨酸合成酶复合体中的关键酶PgsB为酰胺键连接酶，有依赖于谷氨酸的ATP水解酶特性，因此可通过测定ATP水解酶活性来间接测定-聚谷氨酸合成酶活性。具体方法可参见文献11。8） -聚谷氨酸的分离纯化采用有机溶剂沉淀法。利用离心的方法去除发酵液中的菌体，用盐酸将上清液的pH值调至35，然后加入低级有机溶剂，如甲醇、乙醇，丙酮等，加入量为上清液体积的25倍，沉淀得到-聚谷氨酸。将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到白色粉末状物质，此白色物质为-聚谷氨酸。9） -聚谷氨酸理化性质鉴定 溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂；茚三酮发应呈阴性，用6MHCl水解后茚三酮反应呈阳性；6MHCl水解后用HPLC和薄层层析法检测，分析水解物中是否生成单一氨基酸谷氨酸。证明该聚合物为谷氨酸的高分子聚合物；通过SDSPAGE和凝胶过滤色谱等方法分析该聚合物的分子量。年度研究计划：本课题计划二年内完成。具体安排和进度如下：第一年度（2006,1-12）：在谷氨酸棒杆菌中筛选谷氨酸高产菌株，建立pgsBAC基因过量表达体系和基因整合体系，构建-PGA高效工程菌株。第二年度（2007,1-12）： 引入转座子插入突变技术进行大规模-PGA异常代谢的插入突变菌株的筛选；采用转座子挽救法定位分析, 获取参与-PGA合成酶基因表达调控的相关基因信息；撰写论文和总结报告。4、项目创新之处本项目考虑利用谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌17-21进行生产-PGA尝试, 开展-PGA合成酶复合体基因pgsBCA表达载体的构建，以期实现谷氨酸棒杆菌中的-PGA高效表达，这是本项目的特色之一。 此外，利用谷氨酸棒杆菌中成熟的转座子突变筛选技术和基因定向分析方法，进一步从分子水平角度研究谷氨酸棒杆菌-PGA合成的代谢调控作用机理，寻找基因工程技术对-PGA合成的有效调整作用。该项目研究结果将填充国内外-PGA合成代谢调控模式理论，是本项目的又一特色。5、工作基础与工作条件本项目申请人在攻读本科、硕士和博士学位期间，一直从事微生物生化、分子生物学和生物工程学领域的学习和研究，具有扎实的微生物学系统理论知识和娴熟的基因工程实验操作技能。申请人曾参加了多项国家自然科学基金项目的研究工作，博士期间完成了谷氨酸棒杆菌的乙酸代谢调控研究，在转座子突变菌株中寻找并分离到了一个与乙酸代谢调控相关的辅阻遏蛋白基因，并由该基因的过量表达菌株和缺失菌株的构建和分析得以证实，在该微生物基因定点缺失和调控基因研究等方面积累了宝贵经验，已具备了独立承担该课题的工作能力。 特别是本实验室从去年下半年开始, 着手进行了-PGA合成酶基因克隆及其表达的课题研究, 已经成功地从枯草杆菌染色体上分别克隆得到-PGA合成酶的三个酶基因pgsB、pgsA和pgsC，序列分析结果与报道的一致，这为本课题的开展提供了很好的工作支撑。在谷氨酸棒杆菌中构建基因过量表达体系方面, 我们也有成功的经验，加上实验室现有的过量表达载体（大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭质粒，如pXNJ19、pEK0、pEK EX1、pEK EX2等）和染色体基因取代整合载体（pK19mobsacB）行之有效，进行目标基因过量表达和基因染色体定点整合不存在技术障碍。另外，我们的科研意向不仅获得了省内氨基酸生产行业知名企业的关注和菌种支持, 还得到了德国方面的大力支持，德国导师具有长期谷氨酸棒杆菌代谢调控研究的独到经验，在该领域中已建立了一系列很完善的科研体系，这些都将大大有利于本项目工作的开展。本项目组成员中既有从事微生物生化、分子生物学和酶工程的教师，又有硕士生参加，全体人员通力合作能够保证本项目的顺利进行。目前本实验室已有的主要设备：PCR仪、高速冷冻离心机、OLYPUS相差显微镜、层析仪、电激转化仪、核酸蛋白检测仪、酶分析仪、紫外分光光度计、控温摇床、恒温培养箱、电泳仪等，已拥有开展本项目研究工作的实验室条件和仪器。本单位与某高校重点实验室以及中科院某研究所建立了长期的科研协作关系，有共同培养硕士生协议,公共实验平台各种仪器可共享共用，这将更加有利于本项目的进一步开展。6、预期研究结果及其利用研究结果的计划和今后发展的思路预期研究结果1） 构建13株-PGA高效工程菌株，以期在小型发酵罐中无需添加大量的谷氨酸原料进行发酵，可达到20 g/L以上的稳定高产量。2） 获取参与-PGA合成酶基因表达调控的相关信息。3） 预期发表1篇以上SCI研究论文，培养2名硕士研究生。利用研究结果的计划和今后发展的思路今后还将继续致力于谷氨酸棒杆菌代谢调控理论研究，提升该研究系统的综合实力；另外，我们科研发展重心将努力寻求和开拓生物技术的产业化道路， 寻求更广泛的企业投资力度。7、参考文献1. 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