抗体的纯化.docx

一、原理在酸性条件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。二、材料与方法1、材料（1）动物腹水（2）辛酸(caprylic acid，CA)，化学纯（3）硫酸铵，分析纯（4）SPA Sepharose 4FF亲合层析柱2、操作方法（1）蛋白含量测定紫外分光光度法测样品在波长260nm，280nm处的I及收光度(A 260, A 280)，蛋白含量按以下公式计算蛋白量（g/L）=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀释倍数（2）主要步骤腹水滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用Na0H调，PH值至4.5。逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min.离心30分钟，收集上清液。上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，调pH至7.4,置冰浴冷至40度。每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱，40度搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心巧一20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。（3）硫酸铵沉淀法按常规方法将腹水分别经50%，33%饱和度硫酸铵沉淀。（4）亲合层析取提取的样品，用0.01lmol/ L Na2HPO4 (pH7.4)透析，洗脱使样品中IgG结合于层析柱上，再用0. lmol/ L柠檬酸(pH4.0)洗脱，收集洗脱液即获纯化IgG。（5）SDSPAGE电泳鉴定抗体纯度（6）间接ELISA法测定抗体效价用sIgA包被酶标板，按常规方法测抗体效价。处理细胞，包被酶标板，测定抗体效价。（7）得率和回收率的计算每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field，g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery，%)。抗体的纯化 ( 硫酸铵沉淀法）一， 基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二， 试剂及仪器 1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等 2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 4 3. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 4. 蒸馏水 5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 ) 6. 透析袋 7. 超速离心机 8. pH 计 9. 磁力搅拌器 三， 操作步骤 以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸 铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% 50% 。 （一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 C ）. 2.其它不同饱和度铵溶液的配制 （二）沉淀 1.样品（如腹水） 20 000 g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 2.保留上清液并测量体积； 3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 C ），使蛋白质充分沉淀。 （三）透析 1.蛋白质溶液 10 000 g 离心 30 min （ 4 C ）。弃上清保留沉淀； 2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 C ），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 四，应用提示 （一） 先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。 1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ； 2.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时 或过夜（ 4 C ）；3.3000 g 离心 30 min （ 4 C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨； 4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；