PDCD5研究思路.ppt

1 PDCD5的发现和功能研究北京大学医学部马大龙 2 前言 Lifecannotexistwithoutdeath 每个人每天有5千万到7千万个细胞死亡 细胞凋亡 Apoptosis 是程序化细胞死亡 Programmedcelldeath PCD 的一种形式 在细胞分化 增殖 生长和疾病中起着重要的作用 如果机体缺乏凋亡 一个80岁的老人将有2吨重的骨髓和淋巴节 16公里长的肠道 Nature 412 23 2019 3 凋亡缺陷导致的疾病 肿瘤 SLE 多发性硬化症 糖尿病 类风湿关节炎等凋亡过强导致的疾病 AIDS 中风 神经退行性疾病 脊髓损伤等 4 提出思路 克隆化新的凋亡调控基因 将有助于阐明凋亡机理 为凋亡异常疾病防治提供基础 细胞凋亡过程中 将有一些基因表达改变 特别是上调表达基因 可能发挥重要的凋亡调节作用 5 2019年 利用cDNA RDA RepresentativeDifferencesAnalysis 技术 本室从诱导凋亡的TF 1细胞克隆了凋亡上调表达的人类新基因 命名为TFAR19 TF 1apoptosisrelatedgene 2019年国际基因命名委员会命名为PDCD5 ProgramCellDeath5 6 RDA技术路线图 7 正常培养的TF 1细胞 Driver 进入凋亡的TF 1细胞 Tester 三轮cDNA RDA DNA测序和基因库检索 用SlotBlots和NorthernBlots检测表达的差异 RACE方法克隆PDCD5的全长序列 PDCD5在E coli中的表达 纯化 PDCD5真核表达载体的构建 PDCD5的胞内定位 抗体制备和免疫检测 PDCD5蛋白质的活性研究 PDCD5转染的活性研究 PDCD5在组织和细胞中表达检测 8 ResultofNorthernblotsofPDCD5 TFAR19 LeftisRNAfromnormal culturedTF 1cellRightisRNAfromTF 1cellundergoingapoptosis 9 SequenceofPDCD5cDNA CTGCTCCAGCGCTGACGCCGAGCCATGGCGGACGAGGAGCTTGAGGCGCTGAGGAGACAGAGGCTGGCCGAGCTGCAGGCCAAACACGGG90METAlaAspGluGluLeuGluAlaLeuArgArgGlnArgLeuAlaGluLeuGlnAlaLysHisGlyGATCCTGGTGATGCGGCCCAACAGGAAGCAAAGCACAGGGAAGCAGAAATGAGAAACAGTATCTTAGCCCAAGTTCTGGATCAGTCGGCC180AspProGlyAspAlaAlaGlnGlnGluAlaLysHisArgGluAlaGluMETArgAsnSerIleLeuAlaGlnValLeuAspGlnSerAlaCGGGCCAGGTTAAGTAACTTAGCACTTGTAAAGCCTGAAAAAACTAAAGCAGTAGAGAATTACCTTATACAGATGGCAAGATATGGACAA270ArgAlaArgLeuSerAsnLeuAlaLeuValLysProGluLysThrLysAlaValGluAsnTyrLeuIleGlnMETAlaArgTyrGlyGlnCTAAGTGAGAAGGTATCAGAACAAGGTTTAATAGAAATCCTTAAAAAAGTAAGCCAACAAACAGAAAAGACAACAACAGTGAAATTCAAC360LeuSerGluLysValSerGluGlnGlyLeuIleGluIleLeuLysLysValSerGlnGlnThrGluLysThrThrThrValLysPheAsnAGAAGAAAAGTAATGGACTCTGATGAAGATGACGATTATTGAACTACAAGTGCTCACAGACTAGAACTTAACGGAACAAGTCTAGGACAG450ArgArgLysValMETAspSerAspGluAspAspAspTyrStopAAGTTAAGATCTGATTATTTACTTTGTTTATTGTCTATAGCCTTTTAAAAAAATAAACTTGTTATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA540AAAAAAAAAAAAAAAAAA PDCD5编码蛋白结构比较简单 全长125个氨基酸 不含二硫键 pI5 65 无信号肽 无跨膜序列 与已知人类蛋白无同源性 S118可以被CK2磷酸化 10 PDCD5基因结构图 染色体19q12 q13 1 cDNA 867bp 2718bp 804bp 950bp 323bp Exon1 90bp ATG TGA Exon2 38bp Exon3 62bp Exon4 92bp Exon5 72bp Exon6 167bp 基因组DNA 558bp 编码125个氨基酸 11 PDCD5蛋白在不同种属中序列高度保守 12 PDCD53 Dmodeling 根据1EIJ模建 13 如何开展基因功能研究 1 构建真核表达质粒 转染细胞 通过基因过表达 Overexpression 研究基因功能 2 构建绿色荧光蛋白表达质粒 观察细胞定位 3 表达重组蛋白 观察其对细胞的影响 14 pGEM TTFAR19 EcoRI EcoRI LacZ fiori ori TFAR19 AmpR EcoRI T4Ligase ConstructionofpcDITFAR19 15 PDCD5过表达促进HeLa和MGC 803细胞撤除血清诱导的凋亡 16 DetectionofapoptoticcellsofstabletransfectantsofHeLacellinducedbywithdrawalofserumusingAnnexinV pcDI pcDITFAR19 pcDITFAR19 488nm X400 17 PDCD5对各种细胞具有促凋亡效应 但不能诱导凋亡 18 SV40polyA pEGFP C3 CMVIE NeoR EGFP EcoRI SalI AmpR SmaI BamHl SV40polyA pEGFPC3PDCD5 CMVIE NeoR EGFP BamHI TFAR19 AmpR SmaI BamHl SmaI MCS Tfar19PCRProduct BamHI SmaI XhoI XhoI Klenow SalI EcoRI Klenow T4Ligase ConstructionofexpressionvectorofpEGFPC3 TFAR19 19 CellularlocalizationofPDCD5innucleus GreenFluoresceinProteinstaining 488nm DAPIstaining DAPIwavelength 20 NucleartranslocationofPDCD5inHelacellstreatedwithVP16 0hour30min 2hours8hours 21 NuclearTranslocationofPDCD5inTF 1CellsAfterGM CSFdeprivation A CellswerestainedwithFITC labeled3A3antibodyatdifferenttimepoints andobservedusingCLSM B CellswereculturedinGM CSF freemediumfor16h thenstainedwithFITC 3A3andDAPI NuclearaccumulationofPDCD5andcondensednucleiwereobviouslyobserved YingyuChenetal FEBSLetter 2019 509 191 22 pL pMTY 4 AmpR XhoI StuI ThrombinLinker MS2 EcoRI PstI PDCD5ORFPCRProduct 410bp pL pMTY TFAR19 AmpR XhoI ThrombinLinker MS2 EcoRI PstI TRAF19 SmaI BglI XhoI XhoI StuI Klenow XhoI T4Ligase ConstructionofE coliexpressionvectorofpMTY4 TFAR19 23 ExpressionandpurificationofPDCD5inE coli M proteinmarkerfromPromega1 uninducedwholebacteria2 inducedwholebacteria3 cutafterthrombin4 purifiedPDCD5protein 24 WesternBlotstodetectexpressionofPDCD5proteininnormal culturedTF 1cellsandapoptoticTF 1cells LeftisproteinfromapoptoticTF 1cellsRightisproteinfromnormally culturedTF 1cells 25 PurifiedproteinofPDCD5couldpromotetheapoptosisofTF 1cellsinducedbycytokinewithdrawal 26 重组蛋白PDCD5能够明显抑制IDR诱导的K562细胞的克隆形成数目 27 人PDCD5蛋白的穿膜效应研究 JBC 2019 281 24803 本实验室证明人PDCD5蛋白可以通过clathrin非依赖的途径从细胞外携带生物大分子到细胞内 109 115氨基酸是其活性功能区 通过细胞膜的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 heparansulfateproteoglycan HSPG 介导 PDCD5的穿膜效应提示其可以作为重组蛋白药物发挥促进肿瘤治疗效应 28 Exogenousp53N PDCD5inducesapoptosis 29 如何封闭PDCD5的功能 PDCD5单克隆抗体的细胞内导入PDCD5反义寡核苷酸PDCD5反义RNA表达质粒PDCD5RNA干扰 30 Ruietal LifeScience 2019 MonoclonalantibodyofPDCD5caninhibitetoposideinducedHeLacellsapoptosis 31 ATG SequenceofoligonucleotidesusedinpilotexperimentanddiagramofcorrespondingregionstoORFofPDCD5 32 FACSresultsofJurkatcellapoptosistreatedwitholigonucleotide Nooligo sense AS3 AS2 AS1 33 SequenceofphosphorothioateoligonucleotidestoPDCD5 Antisenseoligos5 AAGCTCCTCGTCCGCC 3 Controloligos5 CACCTACCCATCGGAC 3 Senseoligos5 ATGGCGGACGAGGAGC 3 34 InhibitionofhumanPDCD5proteinthroughantisenseoligonucleotidetreatment 35 InhibitionofApoptosistriggeredbyVP16inJurkatcellsbyantisenseoligonucleotidetoPDCD5 36 MAINAPOPTOSISPATHWAYS 37 Caspaseactivationbyproteolyticcleavage 38 AntisenseoligonucleotidetoPDCD5inhibitCaspase 3Activityindose dependentmanner 39 AntisenseoligonucleotidetoPDCD5inhibitCaspase 3Activation 1 Nooligo VP16 2 Nooligo VP16 3 senseoligo VP16 4 Controloligo VP16 5 Antisenseoligo VP16 40 AntisenseoligonucleotidetoPDCD5doesn tinhibitactivationofpro caspase 9 1 Nooligo VP16 2 senseoligo VP16 3 antisenseoligo VP16 4 Controloligo VP16 41 ThetargetingsequencesofPDCD5siRNAs 42 TheeffectofPDCD5siRNA pGC Non silencing pGC siPDCD5 A Non silencingsiRNA siPDCD5 B C 43 siPDCD5attenuatescellapoptosisinducedbyBaxoverexpression 44 siPDCD5reducesprocaspase 3cleavageandcaspase 3activity LinnanChenetal Apoptosis 2019 11 1 101 111 45 分子机制研究 Pulldown Co IP ELISA实验证明PDCD5结合Caspase 3 促进Caspase 3的稳定性 ELISAforPDCD5 Caspase3interaction 46 PDCD5对caspase 3稳定性的影响 invitro 47 德国Stelzl等2019年利用规模化酵母双杂交发现PDCD5结合HTATIP 组蛋白乙酰转移酶 TIP60 EEF1 翻译延伸因子 RIF1 酵母端粒蛋白同源分子 ACP5 酸性磷酸酶 加拿大Ewing等2019年利用规模化质谱分析发现PDCD5结合VHL 抑癌基因 和GC20 可能的翻译起始因子 48 本实验室利用多指标证明PDCD5结合TIP60 促进组蛋白乙酰化 XuLJetal Neoplasia 2009 4 345 354 49 PossiblemechanismfortheFunctionsofPDCD5inApoptosis 50 PDCD5 VHL Activecaspase 3 Nucleartranslocation TIP60 Histone P53 Apoptosis Acetylation Acetylation PDCD5可能的分子作用机制 51 PDCD5从基础到临床 在疾病时情况下的是否表达异常 遗传变异是否影响疾病易感性 有无临床诊断价值 是否有治疗价值 52 ExpressionofPDCD5mRNAindifferenthumantissues 53 PDCD5在肿瘤中的下调表达 1 肝癌 PNAS 中国普通外科杂志 2 乳腺癌 NEJM 3 白血病 北医学报 LeukemiaRes 4 子宫颈癌 北医学报 5 口腔鳞癌 北医学报 6 卵巢上皮癌 中国妇产科临床杂志 7 甲状腺乳头状癌 中华内科杂志 8 银屑病 中华皮肤科杂志 9 胃癌 预后相关 Apoptosis 10 肺癌 JClinOncol 11 肾透明细胞癌 预后相关 南方医科大学学报 12 脑星型胶质瘤 OncolRep 13 多发性骨髓瘤 中南大学学报 14 骨肉瘤 Apoptosis 预后相关 JSurgOncol 15 前列腺癌 ChinMedSciJ 54 PDCD5的表达与肾癌预后相关南方医科大学学报 2019 26 9 1316 1318 55 PDCD5的表达与胃癌预后相关Apoptosis 2019 11 6 993 1001 56 PDCD5的表达与骨肉瘤预后相关 JSurgOncol 2019Sep24 Epubaheadofprint 57 上调表达1 系统性红斑狼疮 中华风湿病学杂志 2 老年性白内障 眼科研究 3 骨关节炎 ActaPharmacolSin 4 桥本病甲状腺 中华内分泌代谢杂志 5 多囊卵巢综合征 北医学报 58 PDCD5启动子区的功能性SNP 本实验室首次发现在PDCD5启动子区存在2个连锁不平衡的SNP 11G 27Aor 11A 27G前者比后者明显高表达PDCD5白血病患者的杂合子频率明显高于正常人XiMa etal Clin Cancer Res 2019 11 8592 59 PDCD55 调控区两个新SNP的发现 SNPs的筛选 45个样本直接测序 11位和 27位同时出现SNP 60 PDCD5SNP在HeLa细胞的启动子活性 61 PDCD5SNP在HeLa细胞凋亡的启动子活性 HeLa细胞撤血清诱导凋亡 62 PDCD5启动子区SNP的CML基因型频率 Heterozygousratio 25 58 11 85 63 PDCD5SNPs在AML患者中的研究 64 RQ PCR检测不同基因型CML患者PDCD5的mRNA水平 65 66 Spinola等通过SNPs全基因组扫描技术 发现PDCD5基因上游35kb处的SNP与肺癌发病相关 GG或CG基因型携带者肺癌发病风险升高 肺腺癌组织中PDCD5的mRNA比正常肺组织低2 4倍 超表达该基因的人NCI H520细胞系克隆形成能力明显下降 作者认为PDCD5可能是新的抑癌基因 JClinOncol 2019 67 PDCD5在肿瘤治疗中的应用 根据肿瘤治疗现状来看 化学药物治疗仍然是目前主要的治疗手段之一 但由于化疗药的毒性作用 限制了化疗的应用 化疗增敏剂可在亚适剂量化学药物剂量下 提高化学药物疗效 降低其对正常组织细胞毒性 产生抗肿瘤细胞的协同效应 具有重要的临床意义 68 PDCD5腺病毒在裸鼠体内对K562细胞的化疗增敏效应 Apoptosis 2019 13 5 641 648 69 裸鼠瘤内注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性 单纯化疗药IDR的抑瘤率达60 27 时 IDR联合PDCD5抑瘤率可达92 03 LinShietal BBRC 2019 396 224 70 裸鼠腹腔注射PDCD5重组蛋白增加K562细胞对IDR的敏感性 平均瘤块57 7mm3开始治疗 71 重组PDCD5腹腔注射联合IDR治疗实验各组小鼠移植瘤重量 同单独化疗药相比 差异具有统计学意义 P 0 05 同单独化疗药相比 差异具有统计学意义 P 0 001 同伊马替尼治疗相比 差异具有统计学意义 P 0 05 同伊马替尼治疗相比 差异具有统计学意义 P 0 01 肿瘤平均体积达到140mm3开始治疗 72 重组PDCD5对骨肉瘤的化疗增敏作用研究 p 0 01vs control p 0 001vs control p 0 01vs cisplatinCisplatin 2mg kgPDCD5 50mg kg BALB cnudemiceestablisheds c chondrosarco