菊花组织培养

课题一菊花的组织培养 学习目标 掌握植物细胞的全能性 明确植物细胞体现全能性的条件 了解植物组织培养技术在生产中的应用 熟悉植物组织培养的基本过程 了解影响植物组织培养的各种因素 掌握植物组织培养的基本技术 有丝分裂 受精卵 细胞分化 在个体发育中 由一个或一种细胞增殖产生的后代 在形态 结构和生理功能上发生稳定性差异的过程 1 细胞分化的概念 一 知识回顾 黑色素细胞在体外培养30多代后仍能合成黑色素 离体培养的上皮细胞 始终保持为上皮细胞 而不会变成其他类型的细胞 2 稳定性 3 不可逆性 细胞分化发生在整个生命进程中 1 持久性 2 细胞分化的特点 造血干细胞原红细胞早幼红细胞中幼红细胞晚幼红细胞成熟红细胞死亡 4 普遍性 遗传物质没有改变 不同组织的细胞共同来源于受精卵 经有丝分裂产生 3 细胞分化的实质 基因 在个体发育过程中 不同细胞中遗传信息的执行情况不同即基因的选择性表达的过程 红细胞 合成血红蛋白 不合成肌动蛋白 肌细胞 肌动蛋白基因开启 合成肌动蛋白 不合成血红蛋白 肌动蛋白基因关闭 血红蛋白基因关闭 血红蛋白基因开启 试一试 现在你能解释这些现象了吗 4 细胞分化的结果 细胞产生了不同种类的蛋白质即出现了不同的结构和功能 愈伤组织 胚状体 1958 美国 斯图尔德植物组织培养 离体 二 基础知识 一 植物组织培养概念 关键词 外植体 脱分化 再分化 愈伤组织 在无菌和人工控制条件下 将离体的植物 培养在人工配置的培养基上 给予适宜的培养条件 诱导其脱分化产生愈伤组织再分化形成丛芽 最终形成 又称 植物离体培养 器官 组织 细胞 完整的植株 由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程 脱分化产生的愈伤组织继续进行培养 又可以重新分化成根或芽等器官的过程 用于离体培养的植物器官或组织片段 细胞排列疏松 无规则 高度液泡化的无定形的薄壁细胞 外植体 脱分化 或去分化 再分化 愈伤组织 切取形成层 无菌接种 诱导愈伤组织的形成 试管苗的形成 培养室 移栽 脱分化 再分化 二 植物组织培养的基本过程 植物组织培养过程 离体组织或细胞 植物体 细胞分裂素 生长素 愈伤组织 芽 根 细胞分裂素 生长素 细胞分裂素 生长素 植物细胞培养 不需要光 需要光 三 植物组织培养的理论基础 细胞全能性 概念 高度分化的植物细胞 仍然具有发育成完整个体的潜能 基础 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质 表达条件 离体条件无菌操作适宜物质的诱导和调节 植物激素 适宜的营养物质温度 酸碱度 光照等条件的控制 思考 这个试验说明了已经分化的细胞核具有什么特性 高度分化的动物体细胞的细胞核有发育成完整个体的潜能 对比 多利羊的诞生 动物细胞有没有这种能力 已经分化的细胞 核 仍然具有发育成完整个体的潜能 细胞全能性 思考 为什么已经分化的细胞具有全能性呢 高度分化的细胞含有保持物种发育所需要的全套基因 1 培育无病毒植株 2 大规模培养愈伤组织 提取紫草素 治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料 4 基因工程中亦需用到植物组织培养的方法 受体细胞为植物细胞 四 植物组织培养的应用 3 人工种子 解决有些作物品种繁殖能力差 结子困难或发芽率低等问题 人工种子 三 影响植物组织培养的因素 1 材料的种类 年龄及保存时间长短等2 营养3 植物激素4 PH 温度 光照等条件 1 植物材料的选择 直接关系实验的成败 不同植物的组织培养难度不同eg 烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝 同一种植物材料 材料的年龄 保存时间的长短等也会影响实验结果 2 营养 MS培养基 A 大量元素 B 微量元素 C 有机物 D 植物激素 赤霉素等 主要影响蛋白质 核酸的合成 K Ca Mg S主要影响酶的活性 无机盐 蔗糖既是碳源也是调节渗透压的物质 维生素能促进细胞分裂和诱导器官分化 甘氨酸是蛋白质的组成成分 也是有机氮源 N P K Ca Mg S B Mn Cu Zn Fe Mo I Co 甘氨酸 烟酸 肌醇 维生素 蔗糖 生长素 细胞分裂素 MS固体培养基成分及比例 讨论 你能说出各种营养物质的作用吗 同专题2中微生物培养基的配方相比 MS培养基的配方有哪些明显的不同 答 微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐 蔗糖提供碳源 同时能够维持细胞的渗透压 甘氨酸 维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求 微生物培养基以有机营养为主 与微生物的培养不同 MS培养基则需提供大量无机营养 无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类 常用植物激素 生长素 细胞分裂素和赤霉素生长素 细胞分裂素是启动细胞分裂 脱分化和再分化的关键性激素在生长素存在的情况下 细胞分裂素的作用呈加强的趋势激素的使用顺序 使用的量及比例影响植物细胞的发育方向 3 植物激素的影响 生长素类 2 4 二氯苯氧乙酸 2 4 D 吲哚乙酸 IAA 萘乙酸 NAA 吲哚丁酸 IBA 等 细胞分裂素类 激动素 KT 6 苄基嘌呤 6 BA 玉米素 ZT 等 赤霉素类 赤霉酸 GA3 等 作用 2 4 D有利于愈伤组织的生长 IAA NAA IBA有利于器官分化 作用 促进细胞的分裂与分化 其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成 作用 促进不定芽和幼株伸长 激素的使用顺序 使用量及比例影响植物细胞的发育方向 植物组织培养过程 离体组织或细胞 植物体 脱分化 细胞分裂素 生长素 愈伤组织 芽 根 细胞分裂素 生长素 细胞分裂素 生长素 再分化 植物细胞培养 不需要光 需要光 需光否 a b A B C 补充下图 注 a b过程 A B C为激素使用比例 a过程分裂方式 b过程分裂方式 有丝分裂 有丝分裂 思考 以下培养基出现的现象反应了什么问题 供参考的配方 1 诱导菊花愈伤组织 在MS培养基中加入BA和NAA 质量浓度均为0 5mg 诱导菊花从芽 在MS培养基中加入BA和NAA 质量浓度分别为2 3mg 和0 02 0 03mg 3 诱导菊花生根 在MS培养基各成分用量减半 并添加入NAA或IAA 质量浓度均为0 1mg 4 温度 光照 pH的影响 光照 菊花每日用日光灯照射12h 温度 大多数植物组织培养控制在23 27 低于15 时植物组织会表现生长停止 高于35 时对植物生长不利 菊花的组织培养控制在18 22 pH 不同植物对培养基最适pH的要求不同 大多数控制在5 6 5 菊花的组织培养控制在5 8左右 制备MS固体培养基 外植体消毒 接种 培养 栽培 四 实验操作 移栽 冲洗 酒精 无菌水冲洗 氯化汞 无菌水冲洗至少三次之上 配制各种母液配制培养基灭菌 一 制备MS固体培养基 MS培养基包括20多种营养成分 实验室一般使用4 保存配制好的培养基母液来制备 1 配制各种母液 无机物中大量元素浓缩10倍 微量元素浓缩100倍 常温保存 激素类 维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg ml的质量浓度单独配制成母液 用母液配制培养基时 需要根据各种母液的浓缩倍数 计算用量 2 配制培养基 分装到锥形瓶中 每瓶分装50ml或100ml 由于菊花的茎段的组织培养比较容易 因此不必添加植物激素 3 灭菌 分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌 配制培养液 调PH 培养基的分装 在植物组织培养的过程中 为什么要进行一系列的消毒 灭菌 并且要求无菌操作 1 植物组织培养所利用的植物材料体积小 抗性差 对培养条件的要求较高 2 用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长 微生物产生的代谢废物会毒害培养的对象 培养物一旦受到微生物的污染 就会导致实验前功尽弃 因此要进行严格的无菌操作 无菌操作的原因 1 选材 二 外植体消毒 2 消毒 流水冲洗 菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉 用软刷轻轻刷洗 刷洗后在下冲洗20min左右 酒精处理 用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分 放入中摇动2 3次 持续6 7s 立即将外植体取出 在无菌水中清洗 消毒液处理 取出后用吸干外植体表面的水分 放入中1 2min 取出后在无菌水中至少清洗3次 漂净消毒液 流水 菊花茎段 取生长旺盛的嫩枝 体积分数为70 的酒精 质量分数为0 1 的氯化汞溶液 无菌吸水纸 三 接种 1 接种前用体积分数70 酒精擦拭工作台 点燃酒精灯 所有操作在酒精灯旁边进行 每次使用器械后都要灼烧灭菌2 将装有培养基的锥形瓶整齐的排列在酒精灯左侧 将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段 0 5 1cm 3 左手持锥形瓶 右手拉开捆扎锥形瓶的绳子 并将封口膜攥于右手手心 以避免封口膜接触瓶口的一面被污染 左手持瓶 使瓶口旋转通过火焰 4 右手用镊子夹取菊花茎段 插入培养基中 不要倒插 每瓶6 8块外植体 接种后 将封口膜重新扎好 5 接种注意事项 每接种一块外植体前 镊子需放入体积分数为70 的酒精溶液中消毒一次 然后在酒精灯火焰上烧一遍 冷却后再接种 外植体在培养基中要分布均匀 放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定 一般胡萝卜3 4块 菊的茎或叶6 8块 也不要太少 以充分利用培养基中的营养成分和光照条件 插入时应注意方向 不要倒插 茎段 茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分 形态学上端朝上 形态学下端朝下 思考 你打算做几组重复 你打算设置对照实验吗 答 每种材料或配方至少要做一组以上的重复 设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶 与接种操作后的锥形瓶一同培养 用以说明培养基制作合格 没有被杂菌污染 四 培养 接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养 培养期间应定期消毒培养温度控制在18 22 每日用日光灯光照12h 正常苗 污染苗 1 外植体带菌 2 培养基及接种器具灭菌不彻底 3 接种操作时带入 4 环境不清洁 污染途径 五 移栽 移栽生根的菊花试管苗之前 应先打开培养瓶的封口膜 让试管苗在培养间生长几日 一般放置在20 25 的遮荫环境中 适应5 7d 试管苗不萎蔫 有新生长的趋势 便可移栽 1 打开封口膜 2 清洗转移 用流水清洗根部的培养基 将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间 3 移栽 幼苗长壮后 移栽到土壤中 固体基质型 含水量高 蓄水性强 透性好 适合栽培 珍珠岩 珍珠岩是一种火山喷发的酸性熔岩 经急剧冷却而成的玻璃质岩石 有弧形或圆形裂隙 如珍珠的结构 所以被命名为珍珠岩 蛭石是一种天然 无毒的矿物质 在高温作用下会膨胀的矿物 它是一种比较少见的矿物 属于硅酸盐 六 栽培 幼苗移栽后 每天观察并记录幼苗的生长情况 适时浇水 施肥 直至开花 1 培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌 2 外植体的消毒 酒精 氯化汞 3 接种的无菌操作 酒精 酒精灯 灼烧 4 无菌箱中的培养 5 移栽到消过毒的环境中生存一段时间 小组讨论 在整个操作过程中 是如何来实现无菌环境的 结果分析与评价 一 对接种操作中污染情况的分析 二 是否完成了对植物组织的脱分化和再分化 三 是否进行了统计 对照与记录 四 生根苗的移栽是否合格 五 课题延伸 1 一般来说 容易进行无性繁殖的植物 也容易进行组织培养 2 实例 芦荟 豆瓣绿 秋海棠 月季 扦插 嫁接 压条 探究植物激素的使用比例 A 生长素 细胞分裂素 对植物组织培养的影响例如 设计对照实验 1 不加植物激素 2 A 1 3 A 1 4 A 1 菊花的组织培养 再分化 材料性质 营养物质 调节物质 环境条件 外植体的消毒 接种 基本原理 细胞的全能性 基本过程 脱分化 愈伤组织 影响因素 操作流程 配制MS固体培养基 培养 移栽 栽培 练习1 答 植物组织培养所利用的植物材料体积小 抗性差 对培养条件的要求较高 用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长 如一些细菌 真菌等的生长 而培养物一旦受到微生物的污染 就会导致实验前功尽弃 因此要进行严格的无菌操作 2 答 外植体的生理状态是成功进行组织培养的重要条件之一 生长旺盛的嫩枝生理状况好 容易诱导脱分化和再分化 达标检测 1 下列四个选项中 肯定没有采用植物组织培养技术的一项是 A 花药离体培养得到单倍体植株B 秋水仙素处理萌发的种子或幼苗得到多倍体植株C 基因工程培育的抗棉铃虫的棉花植株D 细胞工程培育 番茄 马铃薯 杂种植株 基础巩固 2 菊花的花粉经组织培养可发育成一株幼苗 这一过程不涉及下列哪一项 A 有丝分裂 细胞分化 组织器官的形成B 呼吸作用 光合作用 相关激素的调控C DNA的复制 转录 蛋白质的生物合成D 等位基因的分离 非等位基因的自由组合 3 某花卉感染了植物病毒 叶子呈现疱状 欲培养出无病毒的后代 应采取的方法是 A 用种子培养后代B 用无明显症状部分的枝扦插C 用茎尖进行组织培养诱导出植株D 用叶表皮细胞进行组织培养 诱导出植株 4 下列关于影响植物组织培养的因素的叙述不正确的是 A 幼嫩组织较成熟