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Exendin-4的研究进展 吴海生，紫琅职业技术学院，江苏南通，226002摘要 肠促胰岛素类似物（exendin-4）是从分布于美国西南部与墨西哥北部地区的希拉毒蜥（Heloderma suspectum）唾液中分泌的胰升糖素样肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）类似物，能以葡萄糖浓度依赖方式分泌并降低血糖水平，刺激胰岛细胞再生，诱导前胰岛素基因的转录，促进胰岛素的成熟和分泌。Exendin-4还可以抑制餐后胰高血糖素的产生，延迟胃排空，控制食欲等，且不被二肽激肽酶（dipeptidyl peptidase-, DPP-4）分解，血浆半衰期较长1，成为具有广阔应用前景的治疗型糖尿病的药物。本文主要介绍了exendin-4的作用机制、功能，以及其人工合成多肽exenatide的毒性研究现状。关键词 exendin-4、GLP-1、GLP-1受体、exenatideResearch progress on exendin-4WU Haisheng, Zilang Vocational Technical College , Nantong, Jiangsu 226002Abstract The GLP-1 receptor agonist exenatide is synthetic exendin-4, a peptide originally isolated from the salivary secretions of the lizard Heloderma suspectum (Gila monster). Physiological actions shared by exendin-4 and GLP-1 in mammalian systems included reduction of hyperglycemia, glucose-dependent enhancement of insulin secretion, glucose-dependent suppression of inappropriately high glucagon secretion, promotion of -cell proliferation and islet neogenesis from precursor cells, slowing of gastric emptying, and reduction of food intake. Exendin-4 was developed into a fist-in-class therapy for glycemic control in patients with T2DM based on its resistant to degradation by DDP-4. This article reviews research status, functions, mechanisms and the toxicology of exendin-4.Key words exendin-4、GLP-1、GLP-1 receptor、exenatide1 Exendin-4概述GLP-1受体属于G蛋白偶联胰高血糖素受体家族成员，人类的GLP-1受体位于第6号染色体短臂上。GLP-1受体广泛分布于胰腺细胞、细胞、肾脏、胃小凹、小肠黏膜、心、肺和中枢神经系统。研究表明GLP-1受体敲除小鼠口服葡萄糖后血糖浓度上升，同时血浆胰岛素浓度下降。GLP-1是由末端空肠、回肠和结肠的L细胞分泌的葡萄糖依赖性的肠降血糖多肽激素，该多肽激素能够促进血糖依赖的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，抑制餐后胃排空、食欲以及刺激胰腺细胞的增殖和分化，抑制胰腺细胞凋亡。但由于GLP-1在体内易被二肽激肽酶（dipeptidyl peptidase-, DPP-4）降解，半衰期不足2min，使其并不能作为治疗糖尿病的药物2-4。 作者简介 吴海生（1986- ），男，江苏南通人，助教，本科，从事型糖尿病相关研究，E-mail：。Exendin-4是从美国西南部与墨西哥北部地区的希拉毒蜥（Heloderma suspectum）唾液中分离的天然GLP-1类似物，由39个氨基酸组成，分子式为C184H282N50O60S，分子量为4186.57，与哺乳动物GLP-1的氨基酸同源性为53% 5。哺乳动物GLP-1作为胰高血糖素基因的产物，表达于肠道粘膜L细胞，而exendin-4不是由希拉毒蜥和哺乳动物胰高血糖素基因的同源基因表达。虽然exendin-4和GLP-1不是同源物（图1），但体外实验表明胰腺GLP-1受体对exendin-4和GLP-1有相同的亲和力，并且这两种多肽具有同样的刺激受体的功能。因此，exendin-4是GLP-1受体的拮抗剂，此外，exendin-4不易被DPP-降解6。图1：Exendin-4与GLP-1氨基酸序列的对比Figure1: Comparison of amino acid sequence of Exendin-4 and GLP-12 Exendin-4的作用机制Exendin-4 能增加胞内 cAMP 浓度，刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌，即在血糖浓度高时刺激胰岛素分泌，低浓度和正常浓度时不刺激胰岛素分泌。Exendin-4 还能抑制细胞程序性凋亡，刺激细胞的增殖与生长，同时抑制细胞因子引起的细胞凋亡。另外，Exendin-4 还具有降低餐后血糖浓度和胰高血糖素浓度的作用，以及减缓胃排空，抑制食物吸收，调节葡萄糖在外周组织的转运等生物学效应。Exendin-4与GLP-1 类似，都是小分子多肽类激素，可刺激胰岛素分泌（快反应）、激活胰岛素前体基因的转录（慢反应）。Exendin-4刺激胰岛素分泌的信号传导途径与 GLP-1类似。随着体内葡萄糖的分解，细胞的ATP浓度上升，胞质间 ATP/ADP 的比率上升，促进 Exendin-4 与受体 G 蛋白结合，激活 G 蛋白偶联的腺苷酸环化酶，导致胞内 cAMP浓度增加，蛋白激酶 A（PKA）被激活，PKA 使 KATP通道蛋白磷酸化，K 离子通道关闭，引起膜去极化。膜去极化导致膜两侧的电势差改变，使电势差依赖的L型Ca2+通道激活，胞质间的 Ca2+流入胞内。胞内 Ca2+浓度的增加，促进含胰岛素的囊泡向囊泡分泌区域移动，通过胞吐作用分泌到胞外7,8。Exendin-4 激活胰岛素前体基因转录的信号传导途径与 GLP-1 类似。Exendin-4与细胞上的受体（Re）结合，激活与 G 蛋白偶联的腺苷酸环化酶（Ac），增加胞内 cAMP浓度，cAMP 与 PKA 调节亚基（R）结合，释放出活化的催化亚基（C），C 进入细胞核内磷酸化并激活核转录因子 CREB(cAMP response element binding protein, CREB)，CREB 与胰岛素原基因启动子区域的应答元件 CRE(cAMP response element )结合，促进胰岛素原基因的转录，增加胰岛素的合成9,10。3 Exendin-4的功能Exendin-4首先翻译成 N 端多余45个氨基酸残基的前体，然后在激素原转化酶的催化下分解产生具有生物活性的 Exendin-4。Exendin-4的N端是一段不规则卷曲，第7-28 氨基酸残基形成 螺旋，C 端是不规则亲水片断。Exendin-4 的受体是 G 蛋白，N 端是激活受体信号传导途径的关键区域，中间部位和 C 端是受体结合区域。注射人工合成的Exendin-4(Exenatide，AC2993）后，能够模拟调控机体胰岛素的激素在体内发挥作用，从而达到控制血糖的效果9,10。Exendin-4的功能还包括：（1）改善胰岛细胞的功能：不仅促进胰岛细胞分泌胰岛素，还能促进胰岛细胞的分化和增殖，改善胰岛细胞的功能；（2）以不依赖胰岛素的途径来抑制糖原的降解和促进糖原的合成：Exendin-4能直接作用于肝脏和肌肉细胞，以不依赖胰岛素的途径抑制糖原的降解和促进糖原的合成，达到降血糖的作用；（3）使糖化血红蛋白（HbA1c）维持在理想水平：Exendin-4降低HbA1c的幅度为1%左右，并且在短时间内有良好的降糖作用；（4）通过抑制胃排空来抑制糖尿病患者的食欲，从而有益于糖尿病的治疗。4 Exendin-4的清除Exendin-4的人工合成多肽产物是Exenatide，在高剂量的静脉灌注exenatide（约700倍于临床皮下注射剂量）的大鼠尿液中检测到微量的exenatide，然而尿液中完整的exenatide仅占灌注总肽的0.007%11。因此，对于多肽的再吸收，微量的exenatide经肾小球过滤后可以完整地排出体外。在肾结扎的大鼠模型中，观察到exenatide清除率的降低和血浆T1/2的增加。换言之，肾脏功能缺失的大鼠血浆中完整的exenatide含量上升。与此相比，肝脏功能损伤的大鼠模型与肝功能正常的大鼠模型的exenatide的清除率无较明显差异。因此，临床前研究数据表明exenatide主要是被肾脏清除。此外，在PK/PD大鼠模型的研究中发现，GLP-1受体的清除可能有助于血液中exenatide的清除12。5 Exenatide的毒理学研究5.1 剂量毒性 研究表明，小鼠一次性快速静脉灌注剂量1500g/kg的exenatide，大鼠一次性快速皮下注射剂量3000g/kg的exenatide，以及猴子一次性皮下注射剂量5000g/kg的exenatide时产生最小的中毒反应并且没有致命性。小鼠持续182天皮下注射剂量760g/kg的exenatide，大鼠持续91天皮下注射剂量250g/kg的exenatide，以及猴子持续273天皮下注射剂量150g/kg的exenatide时均发生最小化的中毒反应，并且研究中没有观察到剂量限制或者靶器官中毒现象。在所有持续输注模型中都可观察到体重减轻以及摄食减少现象。在注射剂量18g/kg/天（7倍于人体全身接触剂量）的exenatide的大鼠模型，以及注射剂量13.4g/kg/天（41倍于人体全身接触剂量）的exenatide的猴子模型中可观察到体重减轻以及摄食减少现象。在注射剂量150g/kg/天（454倍于人体全身接触剂量）的exenatide的猴子模型中，可在治疗的一个月内观察到明显的体重减轻，同时还在第91天与第273天中观察到猴子胰腺中胰岛细胞数目略微增加。胰岛细胞的增多伴随着莫里醛品红染色的增加，表明增多的是细胞。在小鼠与大鼠模型中没有观察到胰岛细胞数目的变化。在所有动物模型中均未观察到血糖变化以及退行性病变13。 5.2 Exenatide的致癌性 在为期104周的exenatide致癌性研究中，雌雄各半的大鼠模型每天皮下注射剂量为18g/kg、70g/kg以及250g/kg的exenatide。雌鼠的甲状腺C细胞腺瘤的发生率分别为8%，对照组为5%，而三组分别给予低剂量、中剂量、高剂量（分别为全身最大推荐注射剂量的20g/天 的5倍、22倍、130倍）exenatide 的实验组中甲状腺C细胞腺瘤的发生率分别为14%、11%和23%。改变老鼠年龄差异后，在每天注射两次exenatide的大鼠模型中甲状腺C细胞腺瘤发病率的增加没有统计学意义。 在为期104周的exenatide缓释致癌性模型研究中，雌雄各半的大鼠分别每星期一次性皮下注射剂量为0.3mg/kg、1.0mg/kg以及3.0mg/kg（分别为人体基于AUC的全身接触剂量的2倍、9倍和26倍）的exenatide。与对照组相比，实验组中雌雄大鼠均观察到甲状腺C细胞腺瘤发病率的显著增加。在所有剂量的雌鼠模型中都能观察到C细胞腺瘤的发生率明显的增加（27%-31%），在1mg/kg和3mg/kg注射剂量的雄鼠模型发病率分别为46%和47%。对照组中，雄鼠发病率为13%，雌鼠为7%。在皮下注射剂量为3mg/kg的雄鼠中观察到注射部位组织中良性纤维瘤发生率增加。在所有实验组中均未观察到在注射部位有与治疗相关的纤维肉瘤的形成。人体中是否出现此类现象尚不明确14。5.3 Exenatide的基因毒性 在艾姆斯细菌诱变试验与中国仓鼠卵巢细胞染色体畸变分析中不管有无代谢活化exenatide均不具有诱变性且不会导致染色体断裂,小鼠体内微核形成检测结果为阴性15。5.4 Exenatide对生殖和发育的毒性 每天分别皮下注射剂量为6g/kg、68g/kg、760g/kg的速释型exenatide以研究其对小鼠生育能力的影响。雄鼠在交配4周前和交配中给药，雌鼠在交配2周前以及从交配到怀孕第七天的过程中给药。在760g/kg的实验组中未观察到对生育的不良影响。在雌鼠在交配前2周前以及从交配到怀孕第七天过程中每天分别皮下注射剂量为6g/kg、68g/kg、760g/kg的exenatide，在药物浓度为760g/kg时，亦未观察到对胎儿的不良影响。对怀孕的雌鼠从妊娠期第6至15天（胎儿器官形成过程）分别持续每天皮下注射剂量为6g/kg、68g/kg以及760g/kg的exenatide，在给药浓度为6g/kg时就可观察到胎儿腭裂（有些甚至有漏洞形成），肋骨与颅骨的不规则骨化16。 对怀孕的雌兔从妊娠期第6至18天（胎儿器官形成过程）分别每天持续皮下注射剂量为0.2g/kg、2g/kg、22g/kg、156g/kg以及260g/kg的exenatide，在给药浓度为2g/kg时就可观察到胎儿骨骼的不规则骨化。怀孕雌鼠从妊娠期第6天至哺乳期第20天（幼鼠断奶）每天持续分别皮下注射剂量为6g/kg、68g/kg、760g/kg的exenatide，在给药浓度为6g/kg的产后2-4天可以观察到大量的新生鼠死亡。Exenatide能穿透大鼠、小鼠、家兔以及人体的胎盘屏障导致胎儿对母体的比率很低（0.025）17。因此，为了避免exenatide直接转移到胎儿，建议孕期使用最小剂量。 5 Exenatide引起的不良反应Exenatide用于型糖尿病的临床研究表明，其耐受性良好。不良反应多为轻度和中度，最常见的与计量相关的不良反应为恶心。随着治疗的持续和时间的推移，恶心、呕吐发生率及其严重程度都随之下降。此外，Exenatide还会引起腹泻、消化不良、头晕及头痛等症状，但无严重低血糖的情况发生18,19。总之，大量的非临床研究表明速效型或缓释型Exenatide都不具有基因毒性（常见表现为致癌性），并没有伴随明显的副作用或毒性，包括促进炎症、肿瘤形成与肿瘤的变化。但是，Exenatide对处于妊娠期、哺乳期的动物模型，以及新生儿的致病率与致死率较高。6 Exenatide的研究前景本文在介绍Exendin-4的基础上，综述了当前最新的exenatide用于治疗糖尿病的研究进展，并基于大量临床前数据，阐释其功能、作用机制和毒理学研究。Exenatide通过提高血糖依赖的胰岛素分泌改善血糖控制、抑制胰高血糖素分泌、减轻胃排空率、减少体重以及增加饱腹感，具有很高的临床应用价值。现在，每天注射两次exenatide和每星期注射一次exenatide的治疗方案已在欧洲与美国使用，用于治疗型糖尿病患者和血糖控制较差的患者20。基于现有的临床前研究数据，未来将会研究exenatide对心血管与神经系统疾病的影响研究。参考文献1 Kathleen Dungan，John B BuseGlucagon-Like Peptide 1-Based Therapies for Type Diabetes：A Focus on ExenatideJClin Diabet, 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