电穿孔转染质粒DNA.doc

质粒的构建：1. 酶切反应按照1ugDNA需1-10u内切酶的用量，在反应体系中加入相应的10缓冲液，内切酶的体积不得大于总体积的十分之一，ddH2O补足体系，如需长时间消化，还需加入适量的BSA已稳定内切酶活性。2. DNA片断的回收欲回收的DNA片断经琼脂糖凝胶电泳分离后，切下所需片断所在的凝胶（胶的体积尽可能小），加入3倍体积的BufferQX1,及适量的QIAX(Glassmilk),5510分钟，每隔2分钟涡旋1次，待凝胶完全溶解，12000转离心1分钟，BufferQX1洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶.。再用BufferB洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O,离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。3. DNA片断3凹端的补平于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10）2ul,加水至19ul。然后加入1-5单位Klenow酶，混匀后室温下反应15分钟。待补平反应结束后，于65水浴20分钟使Klenow酶失活，电泳定量后即可用于连接反应或-20保存备用。4. DNA片断3凸端的补平 于Eppendorf管中依次加入DNA0.2-5ug,2mMdNTP2ul,人以一种酶切缓冲液（10）2ul。,加水至19ul。然后加入1-2单位T4噬菌体DNA聚合酶，12温育15分钟，于75加热10分钟，使T4噬菌体DNA聚合酶灭活。5. 载体的脱磷酸化：载体质粒经内切酶酶切后可直接进行脱磷酸化处理。40ul的酶切反应体系，景点永建车酶切完全后可加入10CIAP（牛小肠碱性磷酸酶）缓冲液5ul,水4ul和适量CIAP进行脱磷酸化反应。CIAP的用量依载体5端磷酸的摩尔数及末端性质而定，对于5突出的末端，每100pmol 5末端磷酸需1单位CIAP，对于5凹端或平末端，每2pmol 5端末端磷酸需1单位CIAP,一般2ug 5kb的线性化质粒DNA约翰1.4pmol 5端磷酸。反应条件：1）5突出末端：加入CIAP后于37反应30分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，继续反应30分钟。2）5凹或平末端：加入CIAP后于37反应15分钟，56反应15分钟，再加另一小份CIAP(加入量依DNA量而定)，又于37反应15分钟，56反应15分钟。反应结束后，加300ulCIAP反应终止液（10mM Tris-Cl pH 7.5,1mM EDTA pH7.5,200mM NaCl,0.5%SDS）,依次用酚、酚/氯仿和氯仿抽提，加0.5倍体积7M醋酸铵，2倍体积酒精沉淀，室温晾干，溶于适量TE缓冲液中。6. 连接反应用适当的内切酶酶解载体和插入片断，DNA片断回收后电泳检查比较二者的浓度，按载体：插入片断1：4-6的比例将二者加入到连接反应体系中，加入10连接缓冲液1ul,补水至10ul,取出1ul 作连接前对照，然后加入1单位的T4DNA连接酶（平末端连接加入5单位的T4DNA连接酶），12-14水浴中过夜，平末端连接在20-22进行。次日，转化大肠杆菌感受态细胞。7. 感受态大肠杆菌制备 将宿主菌的单菌落接种到5ml LB培养基中，37振摇过夜，次日，取1/50体积的过夜菌液接种到50-100mlLB培养基中，37振摇，待菌液OD600 接近0.3-0.4时，于4 4000转离心10分钟，收集菌体，取原菌液体积的1/5体积预冷的0.1M CaCl2溶液，轻轻加至菌体中，冰浴上轻轻摇动离心管，使菌体缓慢散开，冰浴静置20分钟，4离心，弃上清。重复上一次操作，同样条件离心收集菌体后，向菌体中加入1/50体积预冷的CaCl2,混匀，冰浴静置12小时后用于转化。感受态细胞于4保存一周仍可维持较高效率，或加入1/10体积的DMSO冻存于-70保存。8. 转化取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置30分钟，然后置于42水浴中热休克90秒，加入0.5ml LB培养基，37振摇40分钟，然后接种于含氨卞青霉素的LB平板上，37孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。或用快速转化法：取新鲜制备的感受态细胞溶液100ul置于1.5ml管中，加入5-10ul连接反应液，轻轻混匀后，冰上静置5分钟，然后涂布于经37预热2小时的含氨卞青霉素的LB平板上，37孵箱培养10-12小时后观察菌落生长情况。该方法适用于质粒和粘端连接产物的转化。9. 质粒DNA的小量制备在1.5mlEppendorf管中，加入过夜培养的转化细菌液，12000转离心30秒，弃上清，加入100ul溶液（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）震荡混匀，在加入200ul溶液（0.2M NaOH,1%SDS）混匀后室温变性5分钟，加入150ul溶液（3M KAC,pH4.6）混匀中和5分钟，12000转离心5分钟，转移上清至另一Eppendorf管中，加入1ml 无水乙醇，-20静置5分钟，12000转离心5分钟，70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于50ulTE缓冲液中。10质粒DNA的大量制备将宿主菌的单菌落接种到含适当抗菌素的5ml LB培养基中，37振摇培养过夜，次日，取0.1ml过夜菌液接种到含抗菌素的25mlLB培养基中，37振摇培养到OD600 接近0.6，将25ml培养物转移至含抗菌素的500mlLB培养基中，37振摇2.5小时（OD600约为0.4），加入2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml）, 37振摇培养过夜，于4 4000转离心10分钟，收集菌体，用20ml含溶菌酶（5mg/ml）的溶液（25mM Tris-Cl pH8.0,10mM EDTA pH 8.0,50mMSucrose）悬浮细菌，室温静置5分钟，加入新鲜配置的溶液（0.2M NaOH,1%SDS）40ml，冰上混匀变性10分钟，加入30ml溶液（3M KAC,pH4.6）中和10分钟。412000转离心20分钟，转移上清至另一管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置30分钟，室温12000转离心15分钟，用70%乙醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于8mlTE缓冲液中,称取8gCSCl加至DNA溶液中，加入0.6mlEB（10mg/ml）溶液中,于20，45000转离心24小时，用毛细管吸出质粒DNA区带。水饱和正丁醇抽提数次去除EB，用4倍体积ddH2O稀释含CSCl的DNA溶液，再用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,-20静置1-2小时，于4 15000转离心20分钟，用70%乙醇沉淀一次，室温晾干后，荣誉适量的（0.5-1ml）TE缓冲液中，电泳检查DNA质量，读取OD260与OD280，计算DNA浓度与纯度。电穿孔转染质粒DNA1) 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。2) 胰酶消化收集贴壁细胞，离心收集细胞。用电转缓冲液洗细胞两次。电转缓冲液为磷酸缓冲液。3) 弃上清，用0.5ml电转缓冲液重悬细胞，细胞浓度最好在2106-2107之间。细胞悬液移入0.4cm电转杯中，加入5-40ug质粒，轻弹混匀。置于冰上10分钟。4) 电击。对大部分哺乳动物细胞，电压为250-400伏，即625-1000v/cm，电容为960uF。在此条件下，电击时间大约在30-50毫伏。不同的细胞电转的最适条件不同，细胞电击后死亡率在40%-60%左右时转染效率最高。5) 电击结束后，将细胞置于冰上10分钟。有文献报道，电击前后置