高效毛细管电泳(WY)

高效毛细管电泳 CapillaryElectrophoresis CE 2 电泳 在电解质溶液中 位于电场中的带电离子在电场力的作用下 以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象 称之为电泳 由于不同离子所带电荷及性质的不同 迁移速率不同 可实现分离 1808年 Reuss 俄国 首次发现电泳现象 1937年 Tiselius 瑞典 用于人血清蛋白质混合液的分离 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定 第一次的自由溶液电泳 第一台电泳仪 1948年 获诺贝尔化学奖 3 经典电泳 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术 按形状分类 U型管电泳 柱状电泳 板电泳 按载体分类 滤纸电泳 琼脂电泳 聚丙烯酰胺电泳 自由电泳 传统电泳分析 操作烦琐 分离效率较低 1981年 Jorgenson和Luckas 用75 m内径石英毛细管进行电泳分析 柱效高达40万 m 促进电泳技术发生了根本变革 迅速发展成为可与GC HPLC相媲美的崭新的分离分析技术 高效毛细管电泳 4 毛细管电泳 CE 又称高效毛细管电泳 HPCE 是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质 以高压直流电场为驱动力 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术 由于毛细管内径小 表面积和体积的比值大 易于散热 因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生 这是CE和传统电泳技术的根本区别 采用了0 05mm内径的毛细管 采用了高达数千伏的电压 5 高效毛细管电泳 高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进 采用了25 100 m内径的毛细管 采用了高达数千伏的电压 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发 大大减小了温度效应 使电场电压可以很高 毛细管电泳的柱效远高于HPLC 理论塔板数高达几十万块 米 特殊柱子可以达到数百万 6 与传统的电泳相比 毛细管电泳的主要特点 一 操作简便 可以自动化二 高效 可以达到非常高的分离效率三 快速 可以在毛细管两端加上高至30kV的高电压四 低耗 毛细管内径很小五 廉价六 毛细管电泳分离模式多样 功能强大 可以用于药物分析 药代动力学研究 手性分离及蛋白质 核酸分离 环境监测 七 与高效液相色谱相比 毛细管电泳具有相当的抗脏能力 7 基本概念 毛细管总长度 L cm 毛细管有效长度 l cm 毛细管的入口端到检测窗口的距离 迁移时间 t min 带电粒子在电场作用下做定向移动的时间 电泳速度 vcm s 在单位时间内 带电粒子定向移动的距离 电场强度 E V cm 电压 毛细管总长度 电泳淌度 cm2 V s 带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比 8 9 检测窗 10 第22章毛细管电泳22 1毛细管电泳的原理 1装置毛细管数据处理电极检测器电极试样缓冲液缓冲液高压电源 可高至30KV 主要构件均为 毛细管 高压电源 在线检测器 进样系统 数据采集处理系统以及计算机等 11 12 1 高压电源 1 0 30kV稳定 连续可调的直流电源 2 具有恒压 恒流 恒功率输出 3 电场强度程序控制系统 4 电压稳定性 输出电压稳定在 0 1 以内 5 电源极性易转换 反向电压也是电泳分析时常常需要的 13 2 缓冲液池1 化学惰性 不与样品发生破坏性作用 2 不影响凝胶的寿命 3 紫外吸收弱 电导率低 4 缓冲容量尽可能大 5 在空气中稳定 14 3 毛细管毛细管是毛细管电泳的核心部件 材料要求 毛细管柱的材料应是化学和电惰性的 紫外光和可见光均可以通过 有一定的柔韧性 易于弯曲 耐用且便宜 目前 主要采用的材料是聚四氟乙烯 石英和玻璃聚四氟乙烯 电渗流可控制 散热差 对短波紫外光有较强吸收玻璃 电渗强 紫外吸收强 机械性能差 石英 它具有表面的金属杂质含量低 有电渗 吸附少等优点 各项性能好 15 3 毛细管管径 目前毛细管的管径为25 100 m 小管径毛细管具有以下优点 首先是减小电流 从而减少自热 在同样电压下 管径越小 电流也就越小 产生的焦耳热也就越少 再者 管径小 散热效果好 管径越小 表面积 体积比越大 散热效果越好 缺点 管径减小 表面积 体积比增大 不利于抑制吸附作用管径小还会导致上样 清洗困难 使光程缩短 检测灵敏度降低 因此 毛细管管径的下限受检测灵敏度的限制 其通常所使用的管径为25 100 m 常用的为50 m和75 m 16 3 毛细管管长在理想条件下 如果电场强度保持恒定 则分离度随着管长的增加而增加 为了保持电场强度的恒定 在增加管长的同时还必须相应地增加操作电压 由于实际上电压的取值有一个极限 不能无限增大 因此 管长也不能无限增加 通常长度 1m 17 3 毛细管添加剂聚乙烯醇改性管壁可完全抑制电渗 防止高极性的 特别是碱性蛋白质粘附 用带羟基的 特别是可电离的碱性聚合物改性 可使电渗流较减少 甚至可以倒向 适于小的阴离子的快选择分离 固载化的改性处理用于分离核苷酸 18 4 柱恒温系统毛细管电泳操作中柱温的影响包括两个方面 一是焦耳热上升 导致峰形 柱效及分离度恶化二是温度波动导致分析结果重现性差毛细管的温控方式一般有气体 液体和固体控温三种 其装置的复杂程度依次加大 但控温效果也依次提高 19 1 气冷恒温通常指通过空调控制环境温度或是在分离室内用风扇等来达到强制对流散热效果 加速毛细管外壁的热交换 从而实现温度控制 气冷控温系统容易实现 不影响分离操作 但控温效果不是十分理想 2 液冷恒温将毛细管置于一恒温液体中 能实现比较精确的温度控制 一般选用水 煤油或是氟代烷烃等作为冷却介质 冷却介质一般由专门的制冷系统冷却或恒温 通过一定的路径进行循环 液冷控温方法对毛细管和仪器设计的要求比较高 需要系统有很好的密封性 电绝缘性和安全保护设计 3 固体温控这种固体恒温方式 通常采用热传导系数较高的合金材料制成帕尔帖电热控制器 能迅速地发散焦耳热 与前两种控温方法相比 这种方式的控温效果要更好 且也更稳定 20 5 检测器要求 具有极高灵敏度 可柱端检测 为了解决因毛细管直径极小 而导致的检测光路短 上样量低的问题 毛细管电泳中通常采用在线检测 检测器位于距进样端约毛细管总长的2 3 4 5处 检测器 数据采集与计算机数据处理一体化 类型检测限 mol特点紫外 可见10 13 10 15通用性好 灵敏度偏低荧光10 15 10 17灵敏度高 样品需衍生激光诱导荧光10 18 10 20灵敏度极高 样品需衍生安培法10 9 10 10灵敏度偏低 操作方便 21 6 数据采集系统毛细管电泳的数据记录 谱图形式和数据处理方法 与色谱相似 可以采用记录仪 积分仪 计算机等不同的手段和方法对电泳图谱进行记录和分析 处理 一系列软件具有谱图处理和定量计算的功能 可以自动判峰 并为这些峰确立恰当的基线 及为重叠峰确立恰当的分割线 软件还允许手动判峰 并在判峰完成后 直接获得谱图中所检测到的峰的出峰位置 峰面积 峰高及半峰宽等相关信息 22 23 24 25 26 4 2电渗流 1 电渗流现象当固体与液体接触时 固体表面由于某种原因带一种电荷 则因静电引力使其周围液体带有相反电荷 在液 固界面形成双电层 二者之间存在电位差 当液体两端施加电压时 就会发生液体相对于固体表面的移动 这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流 electroosmoticflow 简称EOF 27 2 HPCE中的电渗现象与电渗流 用作毛细管材料的熔融石英的等电点为1 5左右 因此在常用缓冲液pH下 表面电离成硅羟基 SiO 管内壁带负电荷 形成双电层 在高电场的作用下 带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动 由于这些阳离子实际上是溶剂化的 故将引起柱中的溶液整体向负极移动 称为电渗流 28 3 HPCE中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质 内表面带负电荷 溶液带正电荷 电渗流流向阴极 内表面带正电荷 溶液带负电荷 电渗流流向阳极 石英毛细管 带负电荷 电渗流流向阴极 改变电渗流方向的方法 1 毛细管改性表面键合阳离子基团 2 加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂 将使石英毛细管壁带正电荷 溶液表面带负电荷 电渗流流向阳极 29 4 HPCE中电渗流的流形 毛细管电泳中电荷均匀分布 整体移动 电渗流的流动为平流 塞式流动 谱带展宽很小 液相色谱中的溶液流动为层流 抛物线流型 引起谱带展宽较大 30 5 HPCE中电渗流的作用 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5 7倍 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为 电渗流 ef阳离子运动方向与电渗流一致 电渗流 ef阴离子运动方向与电渗流相反 0 电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致 1 可一次完成阳离子 阴离子 中性粒子的分离 2 改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性 3 电渗流的微小变化影响结果的重现性 在HPCE中 控制电渗流非常重要 31 32 6 HPCE中影响电渗流的因素 1 电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比 当毛细管长度一定时 电渗流速度正比于工作电压 2 毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同 产生的电渗流大小不同 33 3 电解质溶液pH的影响缓冲液的pH影响管壁基团的解离度 对石英毛细管而言 在pH10时 硅羟基基本完全解离 电渗流的变化很小 在pH处于4 10之间时 硅羟基的解离度随pH的上升而迅速增加 管壁zeta电势增大 电渗流增大 分析时 采用缓冲溶液来保持pH稳定 34 4 温度的影响 毛细管内温度的升高 使溶液的黏度下降 电渗流增大 分析时间减短 分析效率提高 温度变化来自于 焦耳热 焦耳热 毛细管溶液中有电流通过时 产生的热量 温度每变化1 将引起背景电解质溶液黏度变化2 3 但温度过高 会引起毛细管柱内径向温差增大 焦耳热效应增强 柱效降低 分离效率也会降低 35 5 添加剂的影响 1 加入浓度较大的中性盐 如K2SO4 溶液离子强度增大 使溶液的黏度增大 电渗流减小 2 加入表面活性剂 可改变电渗流的大小和方向 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流 加入阴离子表面活性剂 如十二烷基硫酸钠 SDS 可以使壁表面负电荷增加 zeta电势增大 电渗流增大 3 加入有机溶剂 如甲醇 乙腈 使电渗流增大 36 4 3分离类型 介绍常用的几种 根据试样性质不同 采用不同的分离类型 37 一 毛细管区带电泳capillaryzoneelectrophoresis CZE 带电粒子的迁移速度 电泳和电渗流速度的矢量和 正离子 两种效应的运动方向一致 在负极最先流出 中性粒子 无电泳现象 受电渗流影响 在阳离子后流出 阴离子 两种效应的运动方向相反 电渗流 电泳时 阴离子在负极最后流出 在这种情况下 不但可以按类分离 同种类离子由于差速迁移被相互分离 最基本 应用广的分离模式 38 二 毛细管凝胶电泳capillarygelelectrophoresis CGE 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶 其具有多孔性 类似分子筛的作用 试样分子按大小分离 能够有效减小组分扩散 所得峰型尖锐 分离效率高 特点 抗对流性好 散热性好 分离度极高 无胶筛分技术 采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺 柱便宜 易制备 39 三 胶束电动毛细管色谱micellarelectrokineticcapillarychromatography MEKC 1 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂 其浓度达到临界浓度 形成一疏水内核 外部带负电的胶束 在电场力的作用下 胶束在柱中移动 胶束作为一个可移动的固定相 准固定相 40 2 电泳流和电渗流的方向相反 且 电渗流 电泳 负电胶束以较慢的速度向负极移动 3 中性分子在胶束相和溶液 水相 间分配 由于电中性的有机化合物在水相和准固定相之间的分配系数有差异 因而导致被分离组分的流出时间不同 中性分子在胶束相和溶液 水相 间分配 疏水性强的组分与胶束结合的较牢 流出时间长 因此 胶束电动毛细管色谱不仅能够分离荷电离子 而且能够分离中性化合物 4 可用来分离中性物质 扩展了高效毛细管电泳的应用范围 5 色谱与电泳分离模式的结合 41 1 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术 2 毛细管内充有两性电解质 合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物 当施加直流电压 6 8V 时 管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度 3 氨基酸 蛋白质 多肽等的所带电荷与溶液pH有关 在酸性溶液中带正电荷 反之带负电荷 在其等电点时 呈电中性 淌度为零 四 毛细管等电聚焦Capillaryisoelectricfocusing CIEF 42 4 聚焦 具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移 分别到达满足其等电点pH的位置时 呈电中性 停止移动 形成窄溶质带而相互分离 5 阳极端装稀磷酸溶液 阴极端装稀NaOH溶液 6 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测 7 电渗流在CIEF中不利 应消除或减小 43 1 用于分离离子型物质 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子 充满毛细管 和尾随离子 试样离子的淌度全部位于两者之间 并以同一速度移动 2 负离子分析时 前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的 所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进 逐渐形成各自独立的区带而分离 阴极进样 阳极检测 五 毛细管等速电泳Capillaryisotachophoresis CITP 44 3 不同离子的淌度不同 所形成区带的电场强度不同 E 淌度大的离子区带电场强度小 沿出口到进口 将不同区带依次排序1 2 3 4 电场强度依次增大 假设 2 号中离子扩散到 3 号 该区电场强度大 离子被加速 返回到 2 区 当 2 号中离子跑到 1 号区 离子被减速使之归队 4 特点 界面明显 富集 浓缩作用 目前很少应用 capillaryisotachophoresis CITP 45 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液 以 电渗泵 取代机械泵 试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程 毛细管电色谱法是用电渗流或电渗流结合压力流来推动流动相的一种液相色谱法 六 毛细管电动色谱Capillaryelectrokineticchromatography CEC 填充柱的基本结构1入口柱塞 2填充部分 3出口柱塞 4检测窗口 5开管部分 45 46 七 亲和毛细管电泳Affinitycapillaryelectrophoresis ACE 分离原理为 在电泳过程中具有生物专一性亲和力 即受体 receptor 和配体 1igand 相互间发生特异性亲和作用 形成受体和配体复合物 通过研究受体和配体在发生亲和作用前后电泳谱图变化 可获得有关受体和配体亲和力大小 结构变化 作用产物等方面信息 在电泳缓冲液中加入被分析样品的带电亲和配体时 样品进入缓冲体系和配体发生一定程度相互作用 改变样品质量和电荷 导致电泳淌度变化 根据样品在配体加入前后迁移时间变化 可判断样品与配体是否发生亲和相互作用 并可估计亲和力大小 适于相互作用双方结合力较弱 在电泳过程中不断进行结合与解吸过程 还可将亲和配体化学键合到毛细管柱上 制成亲和毛细管柱 亲和毛细管柱增加分离选择性 延长与亲和配体作用力强的样品组分出峰时间 47 48 八 非水相毛细管电泳nonaqueouscapillaryeletrophoresis NACE 用有机溶剂替代水作为电解质 主要用于非水溶性物质的分离优势 1 使很多疏水化合物有可能用CE技术分析 扩展了分析对象的范围 2 其低电泳电流允许高的分离电压而产生较水相小得多的焦耳热 降低由于热效应引起的谱带变宽 提高分离效率 3 改变溶剂的性质 提高分离选择性 4 可与质谱 激光诱导荧光检测器等高灵敏度检测器联用 从而大大提高分析灵敏度 5 简化电泳毛细管和电化学检测器的联结 不需要样品衍生化 降低被分析物与管壁的吸附作用等 49 4 4进样方式 进样量 毛细管长度的1 2 纳升级 非常小 1 流体力学进样 1 进样端加压 2 出口端抽真空 3 虹吸进样 r为圆毛细管半径 c0为样品浓度 t为上样时间 为溶液粘度 L为毛细管全长 50 毛细管一端插入样品瓶 加电压 2 电动进样方式 进样不均 电歧视现象 淌度大的离子比淌度小的进样量大 离子丢失 淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去 特别适合黏度大的试样 51 4 5分离条件选择 4 5 1分离条件选择策略 1 分离模式的选择 2 缓冲溶液的选择 3 电压 4 其他 52 阴离子 由于淌度方向和电渗流的方向相反 流出可能较困难 在这种情况下 宜通过添加阳离子表面活性剂 如CTAB 十六烷基三甲基溴化铵 等来改变电渗流的方向 以求快速 有效地分离 常用的电渗流改性剂有季铵盐 胺及各种有机溶剂等 由于大部分阴离子没有紫外吸收 所以在将紫外检测的毛细管电泳技术用于阴离子的分离分析中常要采用间接检测的方法 阳离子 泳动方向与电渗流的方向一致 电荷差异小的阳离子 电泳速率差异小 不足以获得有效分离 尤其是镧系元素 所以在分离时常常需要加入络合剂 以改变单个离子的淌度 达到分离的目的 4 5 2无机离子 53 手性分子或对映体 是组成相同 结构上互为镜像的一对分子 构象上的差异 导致手性分子具有不同的生物物理效应 通常一个具有药理活性 另外一个活性很低 或没有活性 甚至有毒 通过使用手性添加剂来构建手性环境 适合于毛细管电泳的手性添加剂有 环糊精 CD 及其衍生物 肝素 1 4 D 葡聚糖 手性冠醚等 核心是手性识别作用 这种识别作用导致迁移差异 产生分离 手性物质分离模式的选择主要有CZE和MEKC 4 5 3手性物质 54 在蛋白质分析中 存在问题 一 蛋白 蛋白相互作用 这种相互作用包括结合和解离 同一蛋白质的集聚 不同蛋白质或蛋白质与其它大分子之间的结合或集聚 底物或辅因子键合 以及与相邻组分不同的专一或非专一的键合 4 5 4蛋白质 55 二 蛋白质的吸附 吸附过程至少与三个因素有关毛细管柱表面性质 包括净电荷 离子强度 电荷密度等 蛋白质的物理性质 如等电点 稳定性 电荷分布等 样品 缓冲液体系的性质 如离子强度 缓冲液类型 盐的性质等 减轻蛋白质的吸附的方法 样品处理 样品处理通常是使用改性剂SDS 当蛋白与SDS充分结合后 负电荷会大大超过其原有的电荷 从而能消除不同蛋白之间自然电荷的差异 毛细管涂层技术 为消除吸附作用 还可以采用化学涂层的方法来消除或覆盖毛细管管壁上的硅羟基 缓冲液处理 包括添加高离子强度离子和两性离子或采用极端pH条件 在缓冲液中添加高浓度盐 利用盐和管壁间的吸附竞争 可以使蛋白质从管壁上解吸下来 4 5 4蛋白质 56 DNA分离可以采用CE中的任何模式 采用CZE和MEKC模式对核酸成分进行分析 采用凝胶毛细管电泳 CGE 根据样品大小进行分离 如对核酸片断 核酸序列及PCR产物分析 DNA检测主要采用UV或LIF 激光诱导荧光 检测技术 4 5 5核酸 57 一 离子分析analysisofion 阳离子分析迁移方向和电渗流方向一致 4 5min内分离了24种金属离子 阳极进样 阴极检测 具有很高的灵敏度 4 6应用 58 阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反 速度接近 分析时间长 效率低 质量小 电荷密度大的离子如 SO42 Cl F 等 电泳速率大于电渗流 阳极端流出 在阴极端无法检测 加入电渗流改性剂 十六烷基三甲基溴化胺等 使电泳方向和电渗流方向一致 可在3 1min内分离36种阴离子 阴极进样 阳极检测 离子价态及存在形态分析 59 二 药物分析analysisofpharmaceutics 采用毛细管电泳技术作为药物分离的手段 首先需要判断分析对象的存在状态 以离子形态存在的样品 一般选择CZE分离模式 而非离子状态的样品则选择MECC和CEC分离模式 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段 采用毛细管区带电泳方式 在11min内分离17种药物 60 藤黄绿菌素 Pyoluteorin Plt 是假单胞菌株M18产生的一类抗生素 它能够有效的抑制引起植物根际发病的真菌微生物的繁殖 从而达到保护植物免受病害 Wang等采用毛细管电泳技术检测发酵液中藤黄绿菌素 其检出限和定量限分别达到0 66 g ml和2 20 g ml 图4 8藤黄绿菌素分析图谱 电泳条件 80mmol L pH8 40甘氨酸 氢氧化钠 毛细管总长51cm 有效长度42cm 75 m内径 检测条件 UV吸收 230nm 上样条件 13mbar10s重力上样 电压 25kV 曲线A空白发酵液的电泳图谱 曲线B只含有藤黄绿菌素的发酵液的电泳图谱 曲线C只含有内标苯巴比妥的发酵液的电泳图谱 曲线D加入内标苯巴比妥 样品藤黄绿菌素的发酵液处理后电泳的图谱 61 三 氨基酸与蛋白质分析analysisofaminoacids 采用MEKC模式 在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸 HPCE可取代传统的氨基酸分析仪 62 蛋白质分析 63 五 核酸分析及DNA排序analysisofnucleicacidsandsequenceofDNA 酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离 64 65 六 环境分析 酚类物质是重要的环境污染物 陈璐等人运用毛细管电泳技术检测炼焦废水中酚类物质 其中间甲酚的检出限为1 36 g ml 而通过一定的富集方法其检出限可以达到0 12 g ml 图4 9废水中酚类物质分析图谱 电泳条件 30mMpH8