先天梅毒的实验诊断.doc

先天性梅毒的实验室检查温州医科大学附属第二医院 李向阳梅毒(syphilis)是严重危害人类身心健康的一种性传播疾病，最早起源于美洲，后逐渐传播至全世界。先天性梅毒(congenital syphilis，CS) 是指孕妇体内的梅毒螺旋体(TP)由胎盘垂直传播所致。CS主要由TP通过血源垂直传播：经过胎盘脐静脉进入胎儿体内，导致累及胎儿各器官的梅毒感染；感染胎盘发生动脉内膜炎，形成多处梗死灶，使胎盘功能严重障碍，造成流产、死胎、死产，一般发生在妊娠1618周，亦可导致新生儿死亡及CS。美国CDC孕产妇梅毒和CS的数据表明，CS发病率与人群中成年孕妇梅毒发病率相平行。我国近十多年来随着梅毒发病率的不断上升，CS的发病率也随之上升。中国大陆CS报告发病率1991年为0.01/10万活产数，1997年为0.53/10万活产数，2007年为50.30/10万活产数，2008年为56.76/10万活产数。据统计，未经治疗的原发性梅毒孕妇的胎传率可高达70%100%，二期和三期梅毒孕妇的胎传率分别为90%、30%。孕期患有梅毒的妇女即使经过治疗，其不良结局的发生风险仍然比未感染梅毒孕妇高2.5倍。CS可通过有效的产前筛查并对感染孕妇加以治疗而消除，胎儿的感染与母亲梅毒的病程及妊娠期是否治疗有关。梅毒的病原体为苍白密螺旋体（Treponemapallidum,TP）苍白亚种，又称梅毒螺旋体。有螺旋820个，体长620m，宽0.150.25m，运动特征为弯曲移动、绕轴转动和前后伸缩运动。属厌氧菌，体外不易生存，煮沸、干燥、常用消毒剂均可致其死亡，但对潮湿、寒冷环境的耐受力强。先天梅毒的实验室检查1.直接观察梅毒螺旋体 适用于早期梅毒的诊断。可用暗视野显微镜观察病损基部浆液内的梅毒螺旋体；可用银染色法或特异性荧光抗体染色活体组织检查梅毒螺旋体；在早期胎传梅毒患儿的皮肤黏膜损害或胎盘中可查到TP，可作为诊断依据之一。但检查结果阴性不能排除诊断。2. 血清学试验 人类对TP无先天性或自然免疫力。只有机体感染后才逐渐产生免疫力，对梅毒的免疫为传染性免疫。人类感染梅毒螺旋体后，一方面对感染损伤的局部组织及梅毒螺旋体表面释放的心磷脂类物质发生免疫应答，产生非特异性抗心磷脂抗体( 反应素)；另一方面宿主对梅毒螺旋体的外膜脂蛋白、外膜鞘蛋白等抗原发生免疫应答，产生特异性抗体。所有的血清学试验都不能用脐带血，因脐带血可被母血污染而产生假阳性结果。（1）非TP抗原血清学试验 当TP侵入组织后，组织中的磷脂可黏附在TP上，形成复合抗原，此种抗原可刺激机体产生抗磷脂的自身免疫抗体，称为反应素。非梅毒螺旋体抗原血清试验用相同的标准化抗原(心磷脂、卵磷脂和胆固醇) 测定反应素，如性病研究实验室试验(VDRL)、快速血浆反应素试验(RPR)、不加热血清反应素试验(USR)、甲苯胺红不加热血清反应素实验（TRUST），主要用于梅毒的筛查，同时还可以反映梅毒感染的活动性。由于其他疾病如自身免疫疾病或孕期其他病毒感染包括巨细胞病毒、疟疾等也可产生心磷脂等物质，故可以发生假阳性，所以特异性相对较差。当抗体含量过高时，RPR易出现假阴性反应，即前带现象(prozone phenomenon)及生物学假阳性反应，对潜伏期梅毒和神经梅毒不敏感。VDRL是唯一推荐用于检测脑脊液反应素的实验，对诊断神经梅毒具有重要价值。非TP抗原血清学检查常作为临床梅毒的初筛方法，并作为观察疗效、判断是否复发及再感染的指标。由于抗磷脂抗体(IgG)能通过胎盘进入胎儿体内，因此在诊断CS时，如果胎儿未受感染，抗体滴度会在1：3左右，并自行下降；若滴度持续上升则提示胎儿受TP感染。两次非TP抗原血清学检查抗体滴度变化4倍，即相差2个倍比稀释度(如从1：16降至1：4或从1：8升至1：32)具有重要的临床意义。通常在治疗后一定时间，非TP抗原血清学检查结果转为阴性；但在某些患者中，非TP抗体在较长时问内维持较低滴度，甚至伴随终生,这种现象称作“血清固定反应”。（2）TP抗原血清检查 常用的检查方法有TPPA、TPHA、荧光TP抗体吸收实验(FTA-ABS)、ELISA和蛋白免疫印迹技术（WB）。对大多数患者，不论其治疗与否或疾病活动性如何，一旦TP抗原血清学检查阳性，其终生都将阳性。为了排除非TP抗原血清学实验的假阳性，所有的非TP抗原血清学实验阳性标本必须用特异性TP实验进行确诊。TP和非TP抗原血清学实验阳性的母亲所生的婴儿，均应取婴儿血清进行非TP抗原血清学检查(VDRL或RPR)，均应该进行全面检查以明确有无CS（包括非免疫性水肿、黄疸、肝脾肿大、鼻炎、皮疹和(或)肢体假性麻痹），建议用特异抗TP荧光抗体染色对胎盘或脐带做病理学检查。此外，也可取可疑的损伤部位分泌物或体液(如鼻腔渗出物)行暗视野显微镜检查或直接荧光抗体染色检查。TP抗体可被动转移给婴儿，且能维持到15月龄。如果婴幼儿在18月龄时TP血清学实验呈阳性，则可诊断为CS。（3）WB 是将TP亚种抗原经SDS-PAGE凝胶电泳后，将凝胶中的抗原原位转移至硝酸纤维素膜上，加入待测血清及标记抗体后孵育，经显色后进行结果判断。Herremana等认为如果出现相对分子量为15 000、17 000和47 000的条带中至少有2条阳性可作为CS的诊断证据。Rawstron等认为在分子量为15 000、17 000和47 000的条带中出现任意1条阳性即诊断为CS，47 000及其他2条带中任何1条出现阳性即可诊断母亲梅毒感染。WB法具有较高的敏感度和特异度，优于FTA-ABS，对其他非螺旋体标本没有生物假阳性和可疑反应。(4) FTA-ABS-19S-IgM检测 IgM抗体是梅毒螺旋体刺激机体首先产生的早期抗体，IgM不能通过胎盘，如果婴儿血清中FTA-ABS-19S-IgM阳性则表示婴儿已被感染，故在先天梅毒的确诊中有特殊意义。IgM抗体在治疗后含量降低(转阴) 也显著快于TPPA、RPR；当机体再感染时，又会重新升高。只要体内有活的TP存在, IgM抗体就会维持在一定水平。3聚合酶链反应 通过对选择的组织(损伤部位的分泌物、血清、脑脊液、羊水和胎盘组织等) 用聚合酶链反应（PCR）扩增TP特异性基因DNA片段，从而使经选择的TP DNA拷贝数量增加，用特异性探针进行检测。目前PCR检测TP主要的靶基因有TP47、polA、16SrRNA、tpf-1、BMP、tmpA 和tmpB 等, 以TP47和polA的特异性最高。选择PCR诊断梅毒需要考虑患者所处的梅毒病程阶段和样本来源，以一期和二期梅毒的溃疡和皮损拭子最为适宜，全血、脑脊液、羊水、活检样本、石蜡包埋组织等也可作为待检样本，但灵敏度较低。PCR类型有常规PCR、RT-PCR、巢式PCR、多重PCR、荧光PCR等。RT-PCR具有特异、灵敏、自动化、重复性好和可定量等优点，目前在实验室诊断梅毒中较为常用。荧光PCR对一期梅毒的诊断具有极高的特异性和敏感性，可作为一期梅毒早期诊断的依据，对二期梅毒的诊断不如血清学方法。PCR方法在检测早期梅毒、伴艾滋病梅毒、先天性梅毒、神经性梅毒及判断再感染和复发、区分其它螺旋体感染等方面显示出十分重要的价值。参考文献：1. 裴瑞青，曾铁兵,吴移谋.梅毒分子生物学实验诊断方法的研究进展。微生物学免疫学进展.2010,38(2):75-79.2. 王来栓,倪锦文,周文浩.先天性梅毒的流行病学和诊断治疗现状.中国循证儿科杂志.2010,5(1):64-70.3. 方峰. 早期先天性梅毒诊断和鉴别诊断.实用儿科临床杂志.2006,21（2