应用多重PCR检测冷冻虾类海产品中3种致病菌.doc

多重PCR快速检测水产品中3种食源性致病菌方法的建立夏慧丽1基金项目： 浙江省质监系统科研计划项目（20090237）* 第一作者简介： 夏慧丽（1978-），女（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品质量检测与分析。联系电话 E-mail：。 郑辉台州市质量技术监督检测研究院 浙江 台州 318000摘要：本文基于沙门氏菌(Salmonella typli，St)侵袭性抗原保守基因invA、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)目的基因irgB和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)调控蛋白基因prfA，设计了3对特异性引物，建立了快速检测水产品中 3种主要食源性致病菌的多重 PCR方法。结果显示，沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的多重 PCR 扩增片段产物大小分别为213、 369和517 bp。反应条件优化后，3种目的菌在103CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带，彼此之间无交叉反应，具有良好的特异性和灵敏度。该方法应用于3份人工污染水产样品的检测，并与国标方法对比验证，3种致病菌的整体符合率均达100%。该方法操作简单，检测周期短，灵敏度高、特异性强，能够实现对水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌3种食源性致病菌的快速诊断检测和监控。关键词：多重PCR；沙门氏菌；副溶血性弧菌；单核细胞增生李斯特菌；水产品Establishment of multiple-PCR for diagnosing three foodborne pathogenic bacteria in aquatic productsXia Hui-li Zheng HuiResearch Institute of Quality & Technical Supervision and Inspection, Taizhou, Zhejiang, 318000, ChinaAbstract: A rapid multiplex- PCR method was established in order to detect three foodborne pathogenic bacteria including Salmonella typli，Vibrio parahaemolyticus and Listeria monocytogenes in aquatic products. Three pairs of oligonucleotide primers were designed for multiplex-PCR amplification according to gene coding invasion protein A of Salmonella typli， gene coding immune response of Vibrio parahaemolyticus and regulation histone gene of Listeria monocytogenes. gene of Shigella spp The amplified fragment sizes of these three bacteria were 213 bp, 369 bp and 517bp, respectivelyUnder the optimized conditions, the specificity of the multiplex- PCR was high, and the minimum detection limit was 103 CFU/mL. The multiplex- PCR method was used to analyze three aquatic product samples compared with national standard methods, the coincidence rate of two methods reached 100%. The method developed in this study had high sensitivity and specificity, which could be applied for the rapid detection and molecular epidemiology survey of foodborne pathogenic bacteria in aquatic productsKeywords: Mmultiple-PCR, Salmonella typli, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, Aquatic products0 引言近几年我国水产品消费量不断上升，而水产品在养殖、捕捞、储藏、加工、运输、销售等环节容易受到病原微生物的污染1，因此病原微生物检测是水产品及其加工品卫生检测中的一项重要工作，关系到消费者的健康及生命安全。 其中沙门氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌认为是重要的污染水产品的致病菌2-4，他们广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖区域，寄生在海洋生物体中5，通过污染的动物源性食品感染人类。世界各国已将食源性致病菌的检测列为重要的卫生检出指标之一。常规检测这些致病菌需要分离培养、生化试验和血清学试验等多个步骤，检测周期长、操作繁琐、灵敏度低，而且每次只能检测出一种致病菌。面对食品中污染病原菌种类的日益增加，目前的实验室检测方法明显滞后。随着分子生物学检测技术的发展，尤其是在常规PCR6-8基础上发展起来的多重PCR检测技术，使同时检测多种病原微生物成为可能，该技术具有高效、高产、低成本、速度快等优点，有较好的可操作性，目前已在多种病原微生物的检测中得到初步应用9-15。在现有研究工作的基础上，本研究旨在建立同时针对海产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌三重PCR检测方法，以期指导生产一线的致病菌检测，改善食品高污染现状，确保水产品质量安全。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标准菌株本试验选用的试验菌种由广东环凯微生物科技有限公司菌种保藏实验室进行分纯鉴定后批量生产的冻干质控菌种。沙门氏菌的菌株标准编号CMCC(B) 50071，副溶血性弧菌的菌株标准编号ATCC 17802，单核细胞增生李斯特氏菌的菌株标准编号CMCC(B) 54002。1.1.2 试剂营养肉汤培养基、琼脂粉、基因组DNA提取试剂盒（购于天根生化科技有限公司），PCR扩增试剂盒（购于上海生工生物工程公司），引物由Invitrogen生命技术公司合成，见表1。表1 PCR引物序列Table 1 The primers sequence of PCR 菌株PCR引物目的基因扩增片段长度沙门氏菌（S）Salmonella typliSF：TTACAACGCTCTTTCGTCTGGCSR：AAAATCGGGCCGCGACTTinvA213bp副溶血性弧菌（V）Vibrio parahaemolyticusVF：CGATACACACCACGATCCAGVR：ATACGGCCGGGGTGATGTTTCTirgB369bp单核增生李斯特氏菌（L）Listeria monocytogenesLF：TAATTTAATTTTCCCCAAGTAGCAGGACLR：CTTTCGTTATAATGTCTGGCTTTATCGAprfA517bp1.1.3 仪器DSX-280型高压蒸汽灭菌锅，GNP-9080型隔水式恒温培养箱，SPH-Z102C摇床，Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 17型离心机，朗基科学仪器公司MG96G型的PCR基因扩增仪，天能科技公司的HE-120型水平电泳槽及其配套的电泳仪，北京六一仪器厂的凝胶成像系统。1.2 试验方法1.2.1 菌种培养及基因组DNA模板的制备在无菌条件下，将试验菌种每种细菌最适宜的生产环境和温度下培养24h，吸取1mL培养菌液，利用生工生物工程（上海）有限公司的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取DNA，制备模板DNA，用30L TE重悬DNA，置于-20环境中保存。1.2.2 多重PCR反应条件的优化为增强检测的灵敏性，对PCR体系进行优化，加入等量各引物，利用梯度PCR仪，优化退火温度，在扩增效果最好的条件下，根据条带的亮暗来调整各引物的浓度，再配合其它参数的调节得到最优化的多重PCR扩增反应体系。在单重PCR结果的基础上，在三个菌株的混合DNA模板中分别加入1对、3对引物进行PCR扩增，检验多重PCR扩增的特异性。50L 的PCR反应体系：DNA模板2L，上、下游引物（20mol/L）各2L，dNTPs（2mmol/L）3L，Taq酶（5U/L）0.2L，Mg2+（25 mmol/L）4L，10*Buffer 5L，用双蒸水补足体积。循环参数设置：97预变性10min后进入循环程序：94变性30s，48退火1min，72延伸1min，35个循环数；72 10min。每次进行PCR扩增同时设一空白对照管。1.2.3 多重 PCR方法的特异性采用试剂盒法提取试验菌株的基因组DNA，利用所建立的多重PCR方法进行扩增，验证本方法的特异性。1.2.4 多重 PCR方法的敏感性测定所提取的3种致病菌基因组 DNA浓度，然后分别进行10倍递进系列稀释，从每种致病菌基因组DNA的每个稀释度中各取1L混合, 以此作为模板进行多重 PCR扩增, 以确定其敏感性。1.2.5 人工污染样品检测将建立的多重 PCR检测方法应用于检验检疫实践工作中, 检测小黄鱼、冰带鱼及冻虾仁人工污染样品, 其结果分别与国标法GB 4789.4-2010、GB 4789.7-2008和GB 4789.30-2010进行比较, 验证该方法的可靠性。3 结果与分析3.1 多重PCR反应条件的确定设计的PCR检测方法应具有能从复杂样品中特异性地扩增目标片段的能力，因此选择合适的用于扩增检测的基因是保证检测方法特异性的关键。本试验在单一PCR体系扩增的基础上，优化了多重PCR反应体系及条件，50L多重PCR最佳反应体系为： DNA模板2L，上、下游引物（20mol/L）各2L，dNTPs（2mmol/L）3L，Taq酶（5U/L）0.2L，Mg2+（25 mmol/L）4L，10*Buffer 5L。循环参数为：97预变性10min后进入循环程序：94变性30s，48退火1min，72延伸1min，35个循环数；72 10min延伸补足，单一和多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。图1 三个菌种的三重PCR扩增及单重PCR扩增（M-marker，S-混合的DNA模板中只加入ST菌对应的引物，V-混合的DNA模板中只加入VP菌对应的引物，L-混合的DNA模板中只加入LM菌对应的引物，三重-混合的DNA模板中三对引物都加）Fig. 1 The amplification results of single PCR and multiplex-PCR（M-marker , S- salmonella typli, V-vibrio parahaemolyticus, L- listeria monocytogenes）3.2 多重PCR的特异性利用所建立的多重 PCR方法对表2中7株细菌进行特异性检测试验，结果显示所试沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌三种食源性致病菌均为阳性，说明本研究所建立的多重 PCR方法具有高度特异性。表2 多重PCR特异性结果Table 2 The specificity results of multiplex-PCR assay 菌株名称来源PCR检测结果金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)CMCC(B)51572副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802乙型溶血性链球菌(Beta hemolytic streptococcus)CMCC(B)32210单核增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)CMCC(B)54002大肠埃希氏菌O157：H7(Escherichia coli O157：H7)NCTC12900伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)CMCC(B) 500713.3 多重PCR的灵敏性将供试菌株DNA经十倍梯度稀释至10-8，各稀释度菌液分别培养，计数菌落，在上述优化的多重PCR条件下扩增稀释液中提取的DNA，沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌的最小检测量分别为102CFU/mL、102CFU/ mL、103CFU/mL。即使目的菌种含量很低的样品经过扩增后，都可以进行检测，保证了方法的高灵敏度。3.4多重PCR的实践应用将建立的多重 PCR检测方法对人工污染小黄鱼（接种沙门氏菌和副溶血性弧菌2种菌种）、冰带鱼（接种沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌2种菌种）及冻虾仁（接种沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌3种菌种）样品进行检测，结果显示所建立的多重PCR能够有效地扩增出相应的目的基因片段（见图2），从而识别出3中致病菌中随即接种的任意组合菌种，与国标检测结果（见表3）符合率为100%，说明所建立的多重 PCR方法具有良好的可靠性。图2 人工污染水产品中3种致病菌的多重PCR检测结果Fig.2 Results of detection for pathogens form aquatic products by multiplex- PCR（M-marker，1-小黄鱼，混合的DNA模板中只加入ST和VP菌对应的引物， 2-冻虾仁，混合的DNA模板中三对引物都加，3-冰带鱼，混合的DNA模板中只加入ST和LM菌对应的引物,）表3 人工污染水产品中3种致病菌的国标方法检测结果Table 3 Results of detection for three pathogens from aquatic products by national standard methods水产品名称菌种检出沙门氏菌 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特菌小黄鱼+冰带鱼+冻虾仁+4 讨论 传统的培养鉴定方法费时、费力，本试验新建PCR检测方法从制备样品到得出最终检测结果只需要48 h左右，可以在致病菌的快速、同时检测方面发挥重要作用。在本研究中该方法的检测灵敏度达到103CFU/mL。有研究表明16，大多数致病菌的感染剂量都大于103CFU/mL。本实验检出限在102-103CFU/mL，因此，本研究建立的多重PCR技术的检测灵敏度的下限低于致病菌的最低感染剂量，对致病菌的监测具有重要意义。随着实验条件的逐渐优化，新的靶基因提取技术出现以及与各种技术的整合和发展，如将多重PCR和DH-PLC荧光探针定量技术和PCRDGGE等技术相结合，从而形成一套完整的分子生物学检测体系，使得检测方法具有更高的特异性、灵敏性和稳定性，多重PCR必将有一个更加广阔的应用前景。参考文献1 翁思聪, 朱军莉, 励建荣水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价J. 水产学报, 2011, 35(2): 305-314.2 Su Y C，Liu C C. 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