荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用.doc

文章编号: 100823499 (1999) 0420028204荧光光谱在蛋白质分子构象研究中的应用刘清亮1杨家祥1张玉慧1许兴友2(11 中国科学技术大学 化学系, 安徽 合肥 230026)(21 淮海工学院 化学工程系, 江苏 连云港 222005)摘要荧光光谱法是研究蛋白质在水溶液中分子构象的一种有效方法, 文章综述了常见的蛋白质荧光光谱的研究方法和现象, 并介绍了几种荧光光谱新技术。关键词荧光光谱法; 蛋白质; 构象中图分类号 O 657131文献标识码 A白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸 ( FA D ) 也能发射荧光。T rp、T y r 以及 P h e 由于其侧链生色基团的不 同而有不同的 荧 光 激 发 和 发 射 光 谱 ( 图 1)。 其 中 T rp 的荧光强度最大, T y r 次之, P h e 最小。 因为蛋 白质的荧光通常在 280 nm 或更长的波长被激发, P h e 在绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能 观察到 P h e 的发射。这样蛋白质的内源荧光主要来 自 T rp 和 T y r 残基。T rp 残基对微环境的变化很敏 感, 并 且 大 多 数 蛋 白 质 中 都 含 有 几 个 不 同 种 类 的 T rp 残基, 因而常作为内源荧光探针来研究溶液状 态下蛋白质的构象。前言0蛋白质的研究方法很多, 可以概括为两大类: 一类是测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共振法, 圆二色谱法, 激光拉曼光谱法, 荧光光谱法, 紫外差 光谱法, 氢同位素交换法。另一类是测定晶体蛋白质的分子结构。如 X 2射线衍射分析法和小角中子衍射 法。X 2射线衍射分析法虽然可以较准确地测量晶态蛋白质分子的空间结构, 但有许多蛋白质不能培养出单晶, 方法也很复杂, 而且生命体中的蛋白质多数 以溶液状态存在, 与晶体中的结构往往有一定的差 别。中子衍射法由于仪器昂贵等原因, 目前该方法应 用于蛋白质分子的构象研究才刚起步。 荧光光谱法 是研究蛋白质分子构象的一种有效方法。 它能提供 包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、 荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数, 这些参数从各 个角度反映了分子的成键和结构情况。 通过对这些 参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可 以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化, 从而 阐明蛋白质结构与功能之间的关系。同时, 荧光光谱 法还具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便 等优点。所以, 该方法在蛋白质分子构象研究中得到 越来越广泛的应用。图 1 芳香酸的荧光发射光谱F ig. 1 F luore scen ce em iss ion spec tra of the arom a t ic ac ids蛋白质的荧光光谱1在蛋白质分子中, 能发射荧光的氨基酸有色氨酸 (T rp )、酪氨酸 (T y r) 以及苯丙氨酸 (P h e)。个别蛋除测定蛋白质分子的自身荧光, 即“内源荧光” 收稿日期: 1999207202 中国科学技术大学化学系教授、博士生导师最常见的是 O 2 和 I- , 另外还有丙烯酰胺 (A c r)、琥珀 酰 亚 胺 (N B S )、H 2O 2、二 氯 乙 酰 胺、吡 啶 翁 (C 5H 5N H + )、半胱氨酸、氯化烃、N O 3 - 、IO 3 - 、C s+ 及 C u 2+ 等重金属离子。 其中碘离子 ( I- ) 可以淬灭蛋白质表面的 T rp 残基的荧光, 而不能进入蛋白质分子 的内部淬灭荧光, 因此可以用来测定蛋白质分子表外, 还可以利用荧光探针, 即“外源荧光”。荧光探针又可分为稀土离子荧光探针如铕 ( )、铽 ( ) 和有 机荧光探针如 12苯 胺 基 萘282磺 酸 ( 1, 82A N S ) , 12N , N 2二甲胺基萘252氯磺酸 ( 1, 52DN S2C l) (dan sy lac id ) 和 22对甲胺萘262磺酸 (2, 62TN S) 等。 在已研究的大量蛋白质中, 许多是球蛋白。球蛋白根据其荧光性质不同, 又可分为 A 类蛋白和 B 类 蛋白1 。A 类蛋白能发射 T y r 残基的特征荧光光谱, 且 T y r 残基荧光光谱的位置不受蛋白质构象变化 的影响。B 类蛋白, 由于其分子中从 T y r 残基到 T rp残基之间发生了能量转移, 从而导致 T y r 残基的荧 光淬灭和 T rp 残基的荧光增强。因此 B 类蛋白的荧 光实际上是 T rp 残基的荧光峰。而 T rp 残基的荧光光谱对微环境的变化很敏感, 其峰位一般在 325350 nm 波长之间变动。1. 1 溶剂的影响在溶剂与蛋白质分子的作用过程中, 有两种相 互作用导致荧光发射谱的红移或蓝移:(1) 荧光基团与周围溶液中引发的反应场间的 偶极矩相互作用。(2) 荧光基团与一个或多个溶剂分子间特殊的化学作用。例如向环乙烷中的 22苯氨基萘 (22A N ) 中面 T rp 残基的百分比。 吴双顶等5的研究表明脱去C a2+ 后 的 抗 凝 血 因 子 (A C F ) 中 约 有 体 积 分 数 为46% 的 T rp 残基相对外露。 刘清亮等6 研究了 I- 、C u 2+ 等离子对糖苷水解酶 (N A D a se) 内源荧光光谱的影响,结果表明 C u 2+ 对维持 N A D a se 结构起重要作用, 并求出 C u 2+ 与 N A D a se 在 pH 7. 4 时的结合常数 K EM 为 5. 3103 L m o l。而纤溶组分 (F P ) 中 体积分数为 83% 的 T rp 残基荧光能被 A c r 淬灭, 在 I- = 2. 0 m o lL 时, 只可淬灭 F P 约体积分数为40% 的荧光, 说明 F P 中两种类型的 T rp 残基都存 在7 。 陈真龙等8, 9 实验得到 A c r 和 I- 对出血毒素 (A aH ) 中 T rp 残基的淬灭常数 K sv 分别为 38. 3L m o l 和 4. 27 L m o l, A aH 中的 T rp 残基较大程 度位于分子表面的亲水区。1. 3荧光共振能量转移能量转移现象, 即为内源发色基团发生荧光淬 灭和外源发色基团发生荧光敏化的现象。 通过观测 能量转移现象, 可以得到很多蛋白质分子的结构信 息, 特别是可以应用于溶液中分子的微区结构分析。 Fo r ste r 确 定 了 偶 极2偶 极 无 辐 射 能 量 转 移 理论。S t rye r 和 H au g lan d 将能量转移技术发展为测定 给体2受体之间距离的光谱尺, 并成功地应用于以下三个方面:(1) 有机基团给体和有机基团受体之间的能量 转移及距离的确定。如B e rde 等人基于 Fo r ste r 理论 测定了人血清白蛋白中单一色氨酸与其结合的胆红 素和多烯脂肪酸之间的距离10 。(2) 有机基团给体与金属离子受体之间的能量加入少量的乙醇, 结果引起 22A N1. 2荧光淬灭的光谱红移2 。广义上说, 荧光淬灭是指任何可以使荧光强度降低的作用, 但狭义的定义仅指由于荧光物质分子 与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的荧光 强度降低的现象。荧光淬灭过程包括激发态反应, 能 量转移, 配合物形成和碰撞淬灭。荧光淬灭的机制主 要有两种: 一是静态淬灭, 另一为动态淬灭。 这两种 淬灭机制都遵从 S te rn 2V o lm e r 方程3 : F 0 F = 1+K Q Q 。式中 F , F 0 分别是有和无淬灭剂时的荧光强度,Q 为淬灭剂质量浓度, K Q 为淬灭常数。此外还有转移至三重态的淬灭、发生电子转移反应的淬灭和荧光物质的自淬灭等。 动、静态淬灭都需要荧光基团与淬灭剂分子之间的接触, 故淬灭研究可以揭示荧光基团在蛋白质 中的位置及淬灭剂对它们的渗透程度, 同时因淬灭 剂对荧光物质分子的淬灭作用是有选择性的, 淬灭 作用还可以被用来研究蛋白质分子在溶液中的构 象。 如孙建忠等人4 对荧光淬灭的研究表明天花粉凝 集素 (T KL ) 中 T rp 残基是埋藏于分子内部的疏 水环境中的。可淬灭蛋白质中 T rp 残基的淬灭剂种类很多,转移及距离的确定。 如王守业等11用 T b3+ 作为荧光探针取代了皖南尖吻蝮蛇蛇毒纤溶组分 (F P ) 中的 C a2+ , 发现 F P 中 T rp 残基与 T b 3+ 之间发生比较强 的 能 量 转 移, 利 用 Fo r ste r 理 论 计 算 出 T rp与T b 3+ 之间的距离为 0. 375 nm 。 刘清亮等12发现可用 T b 3+ 全部取代抗凝血分子 (A C F ) 中的 C a2+ , 且T rp 残基在 A C F 中 C a2+ 的结合位点附近。(3) 金属离子给体2受体之间的能量转移及距 离的测定。如W illiam 10 利用 T b 3+ 2C a2+ 离子对作为探针, 测定了嗜热菌蛋白酶分子内一个 C a2+ 离子与Zn 2+ 离子之间的距离为 1. 36 nm , 与晶体结构分析得到的 1. 39 nm 吻合得很好。同步光谱, 则呈现 T rp 的光谱特征15 , 选用 =55nm 进行同步扫描, 则可同时测定 T y r、T rp 和 P h e残基的发射光谱16 。 同步荧光与激发光谱及发射光谱都有关系。 它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性, 因而提高了分析的选择性, 因此同步荧光光谱是分析荧光 光谱重叠的多组分混合物的有效方法。但如前所述, 同步荧光的最佳 难以选择。 解决这一难题的方 法 就 是 三 维 同 步 荧 光 光 谱 法 ( th ree2d im en sio n a lsyn ch ro no u s f luo re scen ce sp ec t rom e t ry, TD SF S)。 最近发展起来的这一新方法已被用于同时测定萘和芘的含量17 。2. 2 三维荧光光谱法三维荧光光谱法是 20 年前提出的一种荧光分 析新方法。 特别是最近提出的三维荧光偏振光谱在研究溶液中荧光物质分子的行为特征方面具有较大 的优越性。 10 年前, 三维荧光光谱法开始应用于生 物医药领域。 最近, 国内的鄢远等人18 已首次将三 维荧光光谱法用于测定溶液状态下蛋白质的构象。 结果表明: 三维荧光光谱法是一种研究蛋白质溶液构象的很有效的分析方法。 该方法能够较直观地表明 T rp 残基在蛋白质分子中的微环境及其在不同 条件下的构象变化, 因而可望得到广泛的应用。三维荧光光谱法是由激发波长 (y 轴)、发射波 长 (x 轴)、荧光强度 (z 轴) 三维坐标所表示的矩阵 光谱 (E x c ita t io n 2Em issio n 2M a t r ix Sp ec t ra) , 也叫总发光光谱 (T o ta l L um in e scen ce Sp ec t ra)。三维荧光 光谱图的表现方式有三种, 即等角三维投影图 ( iso 2 m e t r ic th ree2d im en sio n a l p ro jec t io n ) , 激 发 发 射 矩 阵 (E EM ) 以及等高线 (co n to u r p lo t) 光谱图。陈真龙等采用三维荧光光谱法研究了几种介质既十二烷基磺酸钠 (SD S) , 盐酸胍和乙二胺四乙酸 二 钠 ( ED TA ) 等对皖南尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素2 荧光光谱的一些新方法同步荧光 (Syn chron ous F luore scen ce) 光谱法同步荧光技术是在同时扫描激发和发射波长的 情况下来测绘荧光光谱图。 由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图, 即为同步荧光光谱。它包括固定波长的同步荧光和固定能量的同步荧光两种光 谱。固定波长的同步荧光光谱首先由L lo yd 13 提出,2. 1固定能量的同步荧光光谱则随后由 Imm an 14提出。等人2. 1. 1 固定波长的同步荧光光谱 在同步扫描中,使激发波长和发射波长保持固定的波长间距, 即在 = em - ex = 常数的情况下进行扫描, 以同步荧光 信 号 ( 相对强度) 对发射或激发波长测绘荧光光谱 图, 则为固定波长的同步荧光光谱。在同步扫描的荧光测定中, 同步荧光信号强度I s 是激发波长的函数, 其基本公式为:I s (ex , em ) = K cbE x (ex ) EM (em )(1)式中, c 为待测物质的质量浓度, b 为试样溶液的厚度, K 为实验条件下某常数, E x 为激发光谱的强度 分布, EM 为发射光谱的强度分布。 由 (1) 式可知, 在实验条件保持固定的情况下, 测试物质的同步荧光信号强度与待测物质的质量浓度成正比。 这是定量 分析的依据。在利用同步荧光测试样品前, 值必须慎重选 择, 只有当 恰好为某吸收带和其发射带之间的 波长间距时, 才能观察到同步信号。2. 1. 2 固定能量的同步荧光光谱 固定能量的同 步荧光光谱是指在同步扫描过程中, 使激发波长与 发射波长之间保持着固定的能量差, 既使得 =( 1ex - 1em ) 107(cm - 1 )。为 常 数, 表 示 波 数 差荧光光谱的影响, 发现三维荧光峰的形状(A aH )发生变化或出现新的峰, 特别是加入 ED TA脱去固定能量的同步荧光法与固定波长的同步荧光法相比较, 后者能删除瑞利散射, 但是不能删除拉曼 散射, 反而使拉曼散射加宽。固定能量的同步荧光法 既能删除瑞利散射, 又可消除拉曼散射, 这有利于分 析方法灵敏度和精密度的提高, 故一般选用前一种方法。T y r 和 T rp 的激发光谱很相似, 光谱重叠严重。 采用固定波长的同步扫描时, 由 60 nm 的A aH 中的金属离子后, 在原谱峰的两侧出现两个新的峰, 从而可推测出脱去金属离子的 A aH 的构 象有较大变化并有两个新的发色团形成。总之, 荧光光谱法是研究溶液中蛋白质分子构 象的一种有效的方法, 其测定条件更接近生命体的生理环境, 因而在蛋白质及生命科学研究中具有重 要意义。王守业, 丁兰, 刘清亮, 等. 尖吻蝮蛇蛇毒中纤溶组分11与铽的相互作用 J .6.中国稀土学报, 1999, 17 ( 1) : 1参 考 文 献刘清亮, 徐晓龙, 余华明, 等. 稀土及过渡金属离子对蛇毒内抗凝血因子荧光光谱的影响 J . 中国稀土学 报, 1992, 10 (2) : 106 108.L lo yd J B F. Synch ro n ized exc ita t io n o f f luo re scence em issio n sp ec t ra J . L o ndo n: N a tu re P h y s Sc i, 1971,231: 64 65.Inm an E L , J r J am e s D W inefo rdne r. Co n stan t ene rgy synch ro no u s f luo re scence fo r ana ly sis o f po lynuc lea r a rom a t ic h yd ro ca rbo n m ix tu re s J . A na l C h em ,1982, 54: 2018 2023.M ille r J N. R ecen t advance s in m o lecu la r lum ine s2cence ana ly sis J . P ro c A na l D iv C h em , 1979, 16:203 209.黄贤智, 许金钩, 李耀群, 等. 同步荧光法同时测定色 氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 J . 分析化学, 1987, 15: 199 202.Yan Yuan , X u J ingo u, L in Zh uguang, e t a l. S tudy o n to ta l lum ine scence sp ec t ra. A pp lica t io n o f th e M o n te2C a r lo m e tho d to th ree2d im en sio na l syn2 ch ro no u s f luo re scence sp ec t rom e t ry J . A na l C h imA c ta, 1995, 306 (2 3) : 307 312.鄢远, 许金钩, 陈国珍. 三维荧光光谱法研究蛋白质溶 液构象 J . 中国科学 (B 辑) , 1997, 27 (1) : 16 22.12郭尧 君. 荧 光 实 验 技 术 及 其 在 分 子 生 物 学 中 的 应 用1北京: 科学出版社, 19791136 137.M .2B rand L , Se lisk a r C J , T u rne r D C. P ro be s o f st ruc tu reand func t io n o f m ac rom o lecu le s and m em b rane s M . N ew Yo rk: A cadem ic P re ss, 1971. 17 39.L akow icz J R. P r inc ip le s o f f luo re scence sp ec t ro scop yM . N ew Yo rk: P lenum P re ss, 1983. 260 267.孙建忠, 王克夷. 天花粉凝集素的荧光光谱研究 J . 生 物化学与生物物理学报, 1994, 26 (6) : 649 655.吴双顶, 张祖德, 余华明, 等. 钙离子及酸度对蛇毒抗凝血因子溶液构象的影响 J . 中国科技大学学报, 1998,28 (1) : 104 108.刘清亮, 吴双顶, 余华明, 等. 皖南尖吻蝮蛇毒糖苷水解133144515616酶 (N A D a se ) 的 荧 光 光 谱 研 究 J .1998, 14 (1) : 53 57.无 机 化 学 学 报,王守业, 余华明, 陈真龙, 等. 皖南尖吻蝮蛇蛇毒中纤溶717组分的荧光特性 J .30 (3) : 303 306.生物化学与生物物理学报, 1998,陈真龙, 赵大庆, 刘清亮, 等. 尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素8的 荧 光 光 谱 J .190.无 机 化 学 学 报, 1999, 15 ( 2 ) : 18618陈真龙, 张利民, 丁兰, 等. 皖南尖吻蝮蛇 (A gk ist ro do nacu tu s ) 蛇毒出血毒素 的荧光淬灭研究 J . 化学物 理学报, 1998, 11 (5) : 465 470.马贵斌, 杨频. 能量转移技术及其在溶液分子的微区结构分析中的应用 J . 化学通报, 1993, (3) : 29 32.9作者简介: 杨家祥 ( 1958- ) , 男, 安徽肥东人, 中国科学技术大学化学系副教授, 博士, 主要研究方向为配位化学。10The A pp l ica t ion of F luore scen ce Spec tro scopy to t