交联胶原蛋白的降解表征.doc

交联胶原蛋白的降解表征2OO5年第27卷第3期化学与黏合CHEMISTRYANDAD嬲0N?139?交联胶原蛋白的降解表征何薇婧,黄玉东,李艳辉(哈尔滨工业大学应用化学系,黑龙江哈尔滨15(3001)摘要:胶原蛋白被广泛地作为生物医用材料使用,具有良好的生物相容性,组织再生功能和机械性能.为了探讨交联对胶原蛋白提取的影响,在体外酶降解胶原蛋白的实验中,通过胶原蛋白物理外观形态发生变化,降解液羟脯氨酸含量分析和红外谱图分析等表征方法,考察了经过戊二醛交联所获得不同交联度的胶原蛋白体外降解情况.同时,对其降解原理进行了进一步研究.实验表明经过0.2%戊二醛交联1h的胶原蛋白抗酶解性能最好,基本能满足生物医学材料的要求.关键词:胶原蛋白;戊二醛交联;胶原酶降解中图分类号:TQ322.97文献标识码:A文章编号:10010o17【2005)030139一o4EvaluationonDegradationofCross-linkedCollagenHEWeijing.FIUANGYudhngandLIYahhui(姊.o/却咖,Harb/n/na/ao/Tedmo/o,Harb/n15(3001,Ch/na)A】嘲瑚d:CollaiswidelyusedinbiomedicalfieldforitsexcellentbiocpIity,regeneration0foqandIIl|dcal13lOpPer.Inthevitroc0llaI1asedtexpeaiment,thede目d蚯0fcollagenwithdifferentcrinkdegreescuredbyGTAwasinvestigatedthighthedlm萨0fpbydappearance.analyzingHypcontentinthesupertmtantandIRspectrumaIlals.1heeffects0ftheGTAcroealinkontheo01landthede吕ram日d.ir|iwerestudiedfiJItho-.Itrevealedthatthecollagencrulinkedwith0.2%GTAforlhshowed0pdn咖p豇f0m黜0fanti一伽1l|lg懈山移m,whichcouldmeetthedemands0fthebiomedicaimatedals.Keywords:cott;GTAa懈一link;coll|lg前言胶原蛋白作为引导组织再生的生物医用材料,无论是在被吸收前作为形成新组织的骨架,还是被吸收同化进入宿主,成为宿主组织的一部分,能逐渐成为具有正常生理功能细胞与组织整体的一部分.胶原纤维由于广泛的共价交联,其结构稳定,体内有特异作用于胶原的胶原酶(Collagenase),对其分解起关键作用.因此要求植入体内的胶原蛋白材料具有一定的降解期,研究胶原蛋白的降解特性是具有重要意义的1l.国外在此方面的研究十分活跃,如可以采用质量损失,机械性能下降,相对分子质量下降,羟脯氨酸含量,红外测试,差热分析及扫描电镜等进行降解性能表征.如F.HHeijmen等,通过降解前后拉伸强度的比值反应降解程度,从而比较得出交联处理使胶原蛋白降解程度明显降低.L.H.OldeDamink等对降解过程中单位小时内的质量损失率的探讨,考察了不同的交联处理方法所产生不同效果.PeterAngele等通过测试体外胶原酶降解胶原蛋白后的降解液,来比较了取自不同动物组织的胶原蛋白经过EDC/NHS交联前后的降解特性.国内的李孝建等人5通过测定未交联及不同交联时间的胶原+6一硫酸软骨素膜体外降解液中羟脯氨酸浓度考察降解性能.本实验采用不同浓度的GTA经过一定时间交联反应所得的胶原膜试样,并模拟体内环境,在37C水浴条件下,用胶原酶溶液降解胶原蛋白,通过观察胶原外观形态的变化,用比色法J分析消化液,以及红外光谱分析降解残余物的方法对其降解行为进行表征,并由此得到GTA交联胶原蛋白最佳制备工艺.1材料与方法1.1主要试剂和仪器1.1.1试验主要试剂牛腱市售;胃蛋白酶(1:3oo0)胶原酶(318U/lTlg)上海生工;戊二醛天津市博迪化工有限公司.1.1.2试验仪器收稿日期:20040813作者简介:何薇婧(1980一),女,哈尔滨人,在读硕士研究生,师从黄玉东教授,进行生物医用高分子材料方向的研究.?140?何薇婧等,交联胶原蛋白的降解表征Vo1.27.No.3,2005高速冷冻离fi,机;上海安亭科学仪器厂;721型分光光度计;上海第三分析仪器厂1.2胶原蛋白降解试样的制备取新鲜的牛腱,去筋膜,脂肪等杂质,洗净后将其切成碎末约8g,然后用蒸馏水漂洗,用金属网晾干.实验过程中间歇搅拌,反应温度为35C,醋酸的用量始终为300ml不变.反应结束后,用高速冷冻离心机离心反应液,离fi,速度为12000rpm,温度控制在一44.离fl,后取上清液冷冻干燥.将冷冻离心干燥后的胶原海绵用戊二醛交联.交联浓度分别为0.1%,0.2%,0.5%,交联时间为20min.交联后的胶原海绵用蒸馏水反复冲洗后再漂洗3次.室温风干.将交联后的胶原海绵剪裁成质量约为1O的试样.1.3外观形态的变化.比较降解前后,试样的形态的变化.1.4比色法分析消化液1.4.1降解试剂的配制0.05MriffsHCI缓冲液的配制:称取三羟甲氨基甲烷3.027g,量取盐酸1.72ml,稀释到500ml容量瓶,测得pH=7.59(25).胶原酶溶液的配制:称取胶原酶(318U/mg)0.0157g加入50nd上述缓冲液中,使其浓度为100U/ml,加入0.0289gcaCI2,使其浓度为0.005M,加入O.004gNaN3,使其浓度为O.05mg/n.冷藏保存.酶抑制剂的配制:称取3.740gEDTA一2Na,稀释到50nll容量瓶中.柠檬酸缓冲液:称二水合柠檬酸钠(二级)56.974g,冰醋酸12m1,醋酸钠(含3H20)120g,氢氧化钠34g.用蒸馏水溶解,稀释至1000ml,调pH至6.00(25),在冰箱中保存.0.05mol/L氯胺T:准确称取1.41g氯胺T溶于2om1水中.加入3Om1乙二醇甲醚,再加入柠檬酸缓冲液5Onll(不稳定,I临用前配或在冰箱保存最多一周).3.15mol/L过氯酸:27ml70%过氯酸(二级)用蒸馏水稀释至100ml.10%对二甲氨基苯甲醛:称取10g对二甲氨基苯甲醛(二级),用乙二醇甲醚配至100ml,如不溶解.可于6o水浴中加热溶解(I临用前配).冷藏保存.有结晶析出时,使用前加温溶解.1.4.2实验方法原理:羟脯氨酸的测定方法是基于羟脯氨酸氧化后,其所形成的产物的结构类似于吡咯的氧化物,它能与艾氏试剂(对二甲氨基苯甲醛)缩合而成红色的产物.取用O%,0.1%,O.2%,O.5%戊二醛交联的胶原海绵,分别剪成大小接近质量为40mg的小方块,加入1ml胶原酶溶液,37C恒温开始计时反应.反应1d,2d,3d,4d以后,加入1mlEDTA(O.2M)终止反应.3000r/min离心10min取上清液,沉淀自然风干,备用.将上清液放人透析袋(相对分子质量为8000,直径25mm),使用pH值为7.5的s缓冲溶液100nll(透析袋内外s溶液总体积)作为透析液,4oC透析3d,取透析液1ml加入6mol/L的HCI溶液20ml,130C水解3h,自然冷却,再用6mol/L的NaOH溶液调节溶液至中性.分别取中性的水解反应液1ml于试管内,加0.05mol/L氯胺T1ml摇匀,于室温(2025oC)下放置20min.加3.15mol/L过氯酸Iml,摇匀.放置5min.加10%对二甲氨基苯甲醛1ml充分摇匀,于60水浴内放置20min,自然冷却后,于560nlTl波长处测定吸光度.从羟脯氨酸标准曲线上找到对应反应溶液中羟脯氨酸的含量.1.5红外光谱分析用NIGOLErNexus670傅里叶变换红外光谱仪对降解残余进行红外光谱测定,观察谱图的变化,找出断链方式.2结果与讨论2.1起始试样的特征本降解实验采用的胶原蛋白材料制品,是选取上述正交试验所得的蛋白含量较高的,然后经过冷冻干燥后制得的海绵状胶原蛋白,最后再经过戊二醛交联处理的试样.起始试样的表征见表1.通过DSC和TG表征胶原蛋白的热收缩温度Ts和热分解温度Td.透光率T表征其蛋白含量.表l起始试样的外观形态及其它特征TablelTheappearancesandotherclmracterisficsoforiginalsamples从表1可以看出通过戊二醛交联以后得胶原蛋白,以O.5%的交联效果最好,交联后的胶原蛋白的热收缩温度Ts和热分解温度Td均明显高于其他交2OO5年第27卷第3期化学与黏合CHEMISTRYANDADHESl0N联浓度的胶原蛋白膜.2.2直观形态随降解过程的变化如表2,交联后的胶原膜随着降解时间的变化,其外观形态发生变化.表2降解过程中胶原膜外观变化Table2TheappearancecIl鲫0fc0U均嘶m璐Ilgtllede帆从表2可以看出,未交联和交联剂浓度为0.1%,0.2%,交联时间为20min的试样在降解过程中均溶出,形成小颗粒.交联剂浓度为0.5%,交联时间为20rain的试样仅部分溶出,保持了较好的物理形状稳定性.0.1%,0.2%样品溶出快,因为它们的比表面积较0.5%样品大造成的.它们不能满足材料的力学性能的要求.与之相反,0.5%样品仅部分溶出,在一定时期内具有一定的形状稳定性,与要求相符.增加比表面积和多孔状结构,有利于水的渗透,因而可以加快降解速度.胶原蛋白材料制品的降解速度极大程度上与材料对水的渗透性有关.与水渗透性有关的因素都能影响降解速度.从另一个角度来看,胶原膜粗糙的表面形态有利于酶与聚合物之间的结合,使聚合物与酶发生作用,从而使其降解速率提高,较大的表面积使酶与胶原膜的结合的几率也大,也有利于聚合物的生物降解.而且其影响要远远大于结晶的影响.因此,在高分子材料中,纤维态的聚合物最易降解,纤维越细,表面积越大,其降解性能也就越好.加工过程可以影响材料的致密性,材料对水的渗透性,从而影响它的降解速率.因此,可以通过胶原蛋白的提取和成型工艺条件,制备具有不同生物降解速率的胶原蛋白制品.2.3降解液中羟脯氨酸含量的变化37T:水浴条件下降解胶原,用比色法分析降解液中的羟脯氨酸的含量变化.见图l.搬督降解时N/d图137消化液羟脯氨酸含量变化F.1TheHypcontentd田of剐q皿l伽tat37羟脯氨酸显色后呈现紫红色,但同时受到黄色的显色剂影响,观察到消化液显色以后,颜色变成桔红色.胶原分解后产生含羟脯氨酸的小分子肽和游离的羟脯氨酸,有些研究中通过检验含羟脯氨酸的小分子肽来确定胶原的损耗,因胶原中羟脯氨酸是肽链上的脯氨酸经羟化作用而形成的,而分解作用所释放的羟脯氨酸不再被重复利用来合成胶原,所以含羟脯氨酸的小肽段的出现可正确地反映羟化的胶原的降解.将降解液在波长560nm处比色,发现未交联的试样降解液,交联以后的试样降解液的吸光度均随着降解时间的增加,呈现单调递增的趋势.从图1可以明显看出,未交联试样的降解液吸光度值明显高于交联后的试样,并且在预定的降解试验时间内吸光度增加趋势也明显.说明未交联的胶原蛋白制品降解程度大.曲线的斜率大表征了其降解速率快.通过交联可以显着降低其降解程度.从相对分子质量角度来看,聚合物的相对分子质量也会对其降解速率产生较大的影响.相对分子质量的大小虽然不影响降解速度,但相对分子质量越大,通常,聚合物的相对分子质量增大,其生物降解性能会下降;聚合物的取向度和结晶度越高,结晶规整度越高,聚合物的堆砌密度越高,就越不利于聚合物的生物降解,其降解速率也就越低.而交联虽能破坏聚合物结构的规整性,但又会牵制大分子链的运动和增大大分子的相对分子质量,两者的综合作用最终会使聚合物的降解性能下降.此外,由于交联结构不利于水分子对胶原蛋白膜的渗透,因而使降解程度大大减小.结合实验结果可以发现:在固定时间内,交联后何薇婧等,交联胶原蛋白的降解表征Vo1.27.No.3,2005的胶原蛋白制品比未交联的胶原蛋白制品,抗酶降解性更好.从图1中,曲线的斜率表征了降解速率.可以由此看出,在经过交联以后的试样中,交联剂浓度为0.2%的试样吸光度随降解时间的变化最为缓慢,说明降解速率最低.并且,0.2%的试样在降解4d以后吸光度最低,表明交联剂浓度并非越高越有利于保持胶原蛋白制品的化学稳定性.这可能是因为当交联浓度低于0.2%时,胶原蛋白达不到很好的交联效果,仅仅在胶原表面迅速发生局部交联反应,不完全的交联效果使得抗酶降解性能较交联剂浓度0.2%时更低.而交联浓度过高,在浓度为0.5%时,可能是浓度过高使得胶原发生部分变质,导致胶原蛋白分子链的分解,所以更容易被胶原酶所降解.总的看来,以交联剂浓度为0.2%最为合适,降解速率低,4天后最终的降解程度也小.2.4红外光谱分析对比未交联试样降解前后的红外谱图,发现降解前在3330emI1演变成邻近四个峰和1550emI1处的强峰在降解后的图谱中消失,如图2所示.波数4era.图2未交联试样降解前后红外谱图比较rag.2ThenonerosslinkmmpiesIRspectrumColilpalisonbetweenpre?degradallcandpost-grmhtalion波数/era图3交联试样降解前后红外谱图比较rig.3TheerosslinksamplesIRspectrumcolilpalnbetweenpredegradationandpost?graduation对比交联试样降解前后的红外谱图,同样可以看出在降解前3330emI1在降解后分成两个峰,1550em处的峰在降解后的谱图中消失,如图3所示.未交联试样降解后在30003500emI1出现新的四个吸收峰,是NH2与游离酰胺键的伸缩振动,对照交联试样降解前后的红外谱图,在大约3000em和3400em出现两个新的吸收峰是NH2和NH3伸缩振动.对交联和未交联试样,可观察到在降解前1550em处有强吸收峰,可能有一CONH一的NH变形振动峰,此峰在降解后的谱图中消失,在6901100emI1处,30003500emI1新出现的峰,分别代表CO和一OH的振动和NH2和一OH的振动,羰基/羧基含量增多,说明酶降解只是打开了肽链中酰胺键,采用戊二醛交联的胶原蛋白海绵制品,制止了部分酰胺键水解.3结论聚合物的降解是由多种因素共同作用的结果,主要是材料本身的因素,周围环境的因素的影响.如化学结构,构型,形态,形状,pH值大小,酶的种类,温度等.本实验考察了经过戊二醛交联的不同交联度的胶原蛋白体外酶降解行为.经过对试样外观观察,可见胶原膜的厚度对降解有一定影响.厚度越大,在降解过程中胶原蛋白膜保持其外观形态的稳定性越好.经过分析降解液中的羟脯氨酸含量,发现交联剂浓度为0.2%的降解速率最小,未交联的降解速率最大,降解程度高.通过本试验得出0.2%戊二醛交联1h的胶原蛋白抗酶解性能好,保持形状稳定性优异,可满足生物医学材料的