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荧光染料简介荧光定义 荧光染料会发出荧光，所谓荧光是指物质分子吸收紫外光后发出的可见光荧光以及吸收波长较短的可见光后发出的波长较长的可见光荧光。荧光发生机理 每个分子具有一系列严格的分立能级，室温下物质分子大部分处于基态，当这些物质在光的照射下吸收光能后，进入新的状态，称为激发态。处于激发态的分子是不稳定的，它可以通过以10-9-10-7秒的极短时间内发射光量子回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。激发光谱和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有两个特征光谱-激发光谱和荧光发射光谱。 在测定时，用以激发荧光的吸收光谱，一般称为荧光物质的激发光谱，它是指相对于不同激发波长的辐射所引起物质发射某一波长荧光的光谱。 荧光发射光谱简称为发射光谱，是指某一波长激发光引起物质发射不同波长荧光的光谱。荧光效率和荧光强度 分子能产生荧光必须具备两个重要的条件，一是物质的分子必须具有吸收一定频率光能的基团-生色团，二是必须具有能产生一定光量子的荧光团。 而物质发射荧光的能力用荧光效率表示。荧光效率为荧光团发射荧光的光量子数与生色团吸收的光量子数的比值称。 荧光效率往往小于1。如罗丹明B的乙醇溶液的荧光效率为0.97；荧光素的水溶液的荧光强度为0.65，荧光效率与物质结构有关，还与所处的环境紧密相关。而对于某种荧光物质在特定的环境下它的荧光效率是固定的。 在一定范围内，激发光越强，荧光也越强。即荧光强度（发射荧光的光量子数）等于吸收光强度乘以荧光效率。 提高荧光强度的根本方法 选择适当强度的光源作为荧光物质的激发光源，和选择适合于被检荧光物质选择性吸收的光谱滤光片作为激发滤光片，是提高荧光强度的根本方法。许多染料的最大吸收峰并不是紫外光，而是在400nm-500nm的蓝绿光，所以紫外光不是这些染料的最佳激发光源，可见光才是这些染料的最佳光源。 常用荧光色素波长 名称 最大吸收波长（nm） 最大发射波长（nm） 适用性吖啶橙（Acridine orange）405585 中 吖啶黄（Acridine yellow）455620 好 碘化丙啶（Propidium iodide） 488620 中 溴化乙啶（Ethidium bromide） 488610 中 光神霉素（Mithramycin）457570 好 派若宁Y（Pyronin Y） 488580 好 罗丹明123（Rhodamine 123） 560540-660 中 赫斯特33258（Hoechst 33258） 338505 差 荧光素（Fluorescein）495525 好 荧光黄（Lucifer yellow） 428544 好 伊红（Eosin） 525546 中 四甲基罗丹明（Tetramethyl rhodamine） 555 580 中 SYBR Green 498522 好 SYBR Gold495540 好 SYPRO Orange 475580好 SYPRO Red545635中 NBD467538 好 GelStar495530 好 黄色荧光蛋白EYFP 515530 好 绿色荧光蛋白EGFP 490510 好 蓝色荧光蛋白EBFP 380440 差 常用抗体标记荧光染料的特性及其应用1、FITC（异硫氰酸荧光素）绿色：激发波长488nm，最大发射波长525nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH410）。3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。PI（碘化丙啶）：橙红色620nm5、PE（藻红蛋白）橙黄色：激发波长488nm，最大发射波长575nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）不易湮灭；3)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。9、PE-Cy5：激发波长488nm，最大发射波长670nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与APC搭配。5）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。10、PE-Cy5.5：激发波长488nm，最大发射波长694nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE、APC搭配，荧光干扰小、补偿小，是APC比较理想的搭配。11、PE-Alexa Fluor 700：激发波长488nm，最大发射波长723nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）光淬灭性很强，要绝对避光。12、PE-Cy7：激发波长488nm，最大发射波长767nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）光淬灭性很强，要绝对避光；4）可与FITC、PE搭配，与FITC无光谱重叠，与APC搭配荧光干扰小，补偿小，是比较理想的搭配。13、TR：激发波长595nm，最大发射波长615nm。1）其标记的抗体适用于配备Texas Red激光器的流式细胞仪；2）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。14、APC（别藻青蛋白）红色：激发波长633/635nm，最大发射波长660nm。1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）在BD细胞仪的FL4通道检测，在Beckman Coulter细胞仪只有配备双激光器的FC500才能检测到。630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发15、APC-Cy5.5：激发波长633/635nm，最大发射波长668nm。1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）主要用于四色以上的流式细胞术。16：PerCP（多甲藻黄素叶绿素蛋白）深红色：激发波长488nm，最大发射波长677nm。1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可于FITC、PE搭配，荧光光谱重叠少，对随细胞的特异性结合少，但量子产量较低，适用于较高表达物的检测。 GelStar的特点和使用方法 GelStar GelStar与SYBR Green I灵敏度相当，使用简单。可以电泳前染色和电泳后染色，电泳前染色不会影响样品的相对迁移率。 GelStar使用方法1.按常规操作，制备琼脂糖凝胶，凝胶冷却到50-60，加入10000GelStar染料。电泳双链DNA，使染料在凝胶中的终浓度为1；电泳单链DNA或RNA，使染料在凝胶中的终浓度为2。混匀。 2.按常规方法倒胶，电泳，观察。 SYBR染料简介 SYBR SYBR染料为一种非对称菁化物，它作为一种DNA和RNA染料，与菲啶类染料如溴化乙锭相比具有一定优越性。有三种SYBR染料被用于分子生物学试验中：分别是SYBR Green、SYBR Green和SYBR Glod。所有三种染料在溶液状态基本不产生荧光，然而，当其结合到核酸上时，将产生很强的荧光以及很高量子产额（quantum yield）。比如，SYBR Green在结合到双链NDA上时量子产额为0.8，而SYBR Glod具有0.7的量子产额以及1000倍的增强荧光。由于SYBR染料能产生很强的信号和极低的背景以及对核酸的高度亲和力，它们能在低浓度条件下使用，并比传统的染料如溴化乙锭具有更高的灵敏度。 SYBR Glod是最好的SYBR染料。灵敏度很高，且其信号检测动态范围极佳。由于SYBR Glod通常主要结合在主链的带电磷酸残基上，结合了染料的DNA的电泳迁移会明显减缓，并且有时会造成DNA条带的弯曲。因此，用SYBR Glod进行凝胶染色通常在电泳完成后进行。由于背景染色非常低所以不需要进行脱色。 以上摘自分子克隆实验指南第三版1732-1733页 SYPRO Orange使用方法 SYPRO Orange简介 用SYPRO Orange进行凝胶中蛋白质染色，具有操作简单、快速、灵敏等特点。 SYPRO Orange使用方法 1. 电泳：按照常规方法进行SDS-PAGE电泳。为了提高检测的灵敏度，电泳缓冲液 中的SDS的浓度最好为0.05%（常规浓度为0.1%）。 2. 配制染色液：用7.5%（V/V）的乙酸溶液，按照5000：1的比例稀释SYPRO Orange浓缩液，混匀，制成染色溶液，。 3. 染色：将染色溶液倒入合适的塑料容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-60分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定（一般厚度1mm、15%的凝胶，染色40-60分钟）。 4. 冲洗、观测：用7.5%（V/V）的乙酸溶液短盏冲洗（时间不要超过1分钟），去除凝胶表面染料，用蓝盾观测。 注意 染色溶液可重复使用4次，但使用2次后会降低灵敏度。 不要使用含甲醇的溶液固定蛋白质，甲醇会去除覆盖在蛋白质上的SDS，从而降低SYPRO Orange荧光信号。 超过0.1%的Triton X-100 会影响at 0.1% SYPRO Orange染色，如果在凝胶中使用了超过0.1%的Triton X-100，应用合适的溶液浸泡凝胶，稀释Triton X-100。然后在0.05%的溶液浸泡30分钟后进行染色。 SYPRO Orange不适合在2D PAGE和IEF中对蛋白质进行染色，在这些应用中可使用SYPRO Ruby进行蛋白质染色。 按照以上程序，可以用SYPRO Orange的水溶液进行普通聚丙烯酰胺电泳的蛋白质染色，但灵敏度可能会降低。 强致癌性的溴化乙锭 溴化乙锭简介 观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色，溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍，所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭（0.5ug/ml）时，可以检测到少至10ng的NDA条带。 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA）。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧光产率也相对较低。事实上，大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。 尽管在该染料存在的情况下，线状DNA的电泳迁移率约降低15%，因此，当需要知道DNA片段的准确大小（如DNA限制酶酶切图谱的鉴定），凝胶应该在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色。染色完毕后，通常不需要脱色。但是在检测小量DNA（小于10ng）片段时，通常要将染色后的凝胶进行脱色。 （以上摘自分子克隆实验指南第三版，396-397。） 溴化乙锭的损害 溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性！SYBR Green I 和溴化乙啶（EB）Ames 测试结果显示EB容易引起有机体突变。(Singer et al., Mutat. Res. 199, 439: 37- 47.) 用过的溴化乙锭的处理 由于溴化乙锭具有一定的毒性，实验结束后，应对含EB的溶液进行净化处理再行弃置，以避免污染环境和危害人体健康。 （1）对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 （2）EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理： 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时； 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。 参考资料 1. Brunk, C.F. and L. Simpson. 1977. Comparison of various ultraviolet sources for fluorescent detection of ethidium bromide-DNA complexes in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 82:455-462. 2. Hartman, P. S. 1991. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques 11:747-748. 3. Daum, H.A., H.G. White, C.M. Seidell and P.A. Johnson. 1991. Cloning, rest r ict ion digest ion and DNA label ing of large DNA fragments in th