荧光PCR熔解曲线原理

熔解曲线耐药结核检测技术的原理及应用 随着抗结核药物的广泛使用 耐多药结核病人不 断增加 耐多药结核病 multidrug resistant tuberculosis MDR TB 是指至少同时对利福平 rifampin RIF 和异烟肼 isoniazid INH 这 两种一线抗结核药物耐药 传统的药物敏感实验 Drug susceptibility test DST 时间长 不利于耐 多药结核病患者的及时诊治 因此 发展一种快速 检测耐多药结核病的分子生物学检测技术对于耐多药 结核病的早期诊断和治疗十分重要 一 熔解曲线耐药结核检测技术的发展 结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒和结核 分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒于 2013 年 1 月 获颁国家食品药品监督管理局 SFDA 医疗器械注 册证书 同时 中国 比尔盖茨基金会 已将该 试剂盒纳入该基金会 2013 年产品验证目录 2016 年 9 月 SFDA 批准了另外三种试剂盒 结核分枝 杆菌氟喹诺酮类药物耐药突变检测试剂盒 结核 分枝杆菌链霉素耐药突变检测试剂盒 和 结核分枝 杆菌乙胺丁醇耐药突变检测试剂盒 分别用于检测 结核分枝杆菌对氟喹诺酮类药物 链霉素药物和乙胺 丁醇药物耐药性 可用于临床上结核病的辅助诊断 这些产品上市 有利于对耐多药结核病患者及时诊治 从而更好地控制与治疗结核病 二 熔解曲线耐药结核检测的工作原理 结核分枝杆菌异烟肼 利福平 氟喹诺酮 链霉素 乙胺丁醇耐药突变检 测试剂盒均采用荧光 PCR 熔解曲线法进行检测 荧光 PCR 熔解曲线法是一种简单快速的 PCR 检测技术 其主要检测原理为耐药基因的基因突变会导致 DNA 双链的结合力下降 从而导致相应的 DNA 熔解温度 Tm 值 下降 即野生型基因有特定的 Tm 值 而突变型基因因为结合能力下降导致 Tm 值发生变化 1 Tm 值下降的幅度与发生错配的碱 基数目 类型和位置有关 据此可以区分和检测 出突变型和野生型 三 熔解曲线耐药结核检测产品结构 结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒包含 扩增试 剂 PCR Mix A PCR Mix B及 TB 酶混合液 对 照试剂 阳性对照 含四个野生型扩增靶基因的 质粒 TB 阴性对照 不含靶基因的溶液 四 熔解曲线耐药结核检测的突变位点 2 抗结核 药物 检测的突变位点 RFPrpoB 507 534 核心区位点 INHahpC 启动子区 44 30 以及 15 3 位 点 inhA94 密码子 inhA 启动子区 17 8 位点 以及 katG315 密码子 EMBembB306 embB378 380 embB406 及 embB497 四个常见突变位点 SMrpsL43 rpsL88 密码子 rrs513 517 位点 和 rrs905 908 位点 五 熔解曲线耐药结核检测的优点 熔解曲线检测试剂盒是目前市场上检测项目最齐全的试剂盒 可实现 MDR 和 XDR 一步检测 实验全程采用闭管法操作 无 PCR 后处理 降低了扩增产物交叉污染的 发生率 3 检测时间较短 在 3 小时内完成 可实现自动判读 可在现有的实时荧光定量 PCR 分析仪上操作 不需要昂贵的专用设备 熔解曲线法与现有其他检测方法相比 检测项目 更为齐全 并且可在 3h 左右获得药敏结果 适用于 耐多药结核病的快速筛查 有利于更快的对耐多药患 者进行诊断治疗并减少耐多药患者的传播 这种检测 方法对于我国结核病患者和结核病策略的影响还需要 进行大范围的 进一步的调查研究 参考文献 1 蔡挺 李巧云 张顺 等 基因芯片技术检测常见革兰阴性杆菌 耐药基因的 研究 J 中华医院感染学杂志 2011 21 21 4411 4414 2 严虹 施旭东 胡春梅 等 探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌利福平 异烟肼 乙胺丁醇及链霉素耐药突变 临床检验杂志 2015 33 10 729 733 3 Qiu YH Zan ZL Yi QL et al Multiplex fluorescence melting curve analysi