基因工程名词解释.doc

基因工程概念（狭义）是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上，于上世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。应用基因工程技术完全打破生物界物种的界限，在体外对大分子DNA进行剪切、加工、重组后引入细胞中表达，使其具有新的遗传特性，从而定向改造生物。 广义：指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上下游技术。上游技术指外源基因重组、克隆和表达载体构建；下游技术则涉及含有重组外源基因的生物细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离、纯化过程。基因: 是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。基因特点：基因是实体：DNA或RNA（如烟草花叶病毒）；基因是具有一定遗传效应的DNA分子中特定的核苷酸序列；基因是遗传信息传递和性状分化发育的依据；基因是可分的，根据其编码产物的功能，可分为编码蛋白质基因、tRNA和rRNA，以及不转录却有特定功能的DNA区段（如启动子、操作子基因等）。两个实验：首先用肺炎双球菌实验证明基因的化学本质DNA分子的是美国著名微生物学家O.T. Avery于1944年发表；1952美国冷泉港喀内基遗传学实验室的A.D.Hershey用35S和32P分别标记噬菌体外壳蛋白质与DNA，感染大肠杆菌，证明了Avery的结论。顺反子：在现代的遗传学文献中，顺反子和基因这两个术语是相互通用的，一般说来，一个顺反子就是一个基因，大约含有1500个核苷酸对，是由一群突变单位和重组单位组成的线性结构。因此，基因不是最小单位，它仍然是可分的；并非所有的DNA序列都是编码基因，而只有其中某一特定的多核苷酸区段才是基因的编码区。基因家族是真核生物基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因。假基因：具有与功能基因相似的核苷酸序列，但由于有许多突变以致失去了原有的功能，所以是没有功能的基因，常以表示。现已在大多数真核生物中发现了假基因。基因工程诞生：核酸限制性内切酶：1972年H. Y. Boyer发现EcoRI位点GAATTC。 DNA连接酶：1970年H. G. Khorana发现T4ligase;启动子：是一段供RNA聚合酶定位的DNA序列，通常位于基因上游，长度一般不超过200bp。启动子特点：序列特异性：组成型启动子的DNA序列中，一般约20bp是相对保守的，碱基变化影响转录速度；方向特异性；位置特异性：启动子与转录起始位点间的距离相对固定；种属特异性。启动子类型：组成型、诱导型、组织特异型。原核生物启动子组成-Sextama盒：-35区，RNA聚合酶亚基识别位点 Pribow盒：-10区， RNA聚合酶结合位点，DNA解旋，转录开始 转录起始位点多为CAT，以中间碱基为转录起始位点 间隔区：长度与二盒间互作程度相关。真核基因启动子。I型启动子：位于起始位点-50-30bp区，主要合成pre-rRNA;II型启动子：编码蛋白质，结构复杂；III型启动子：合成5sRNA和tRNA的启动子位于起始位点50-88bp区，属内源启动子；合成snRNA的启动子位于起始位点上游；操纵子基本组成。结构基因: 如糖代谢、转运蛋白等的编码基因。调节基因: 编码以控制其它基因表达RNA 或蛋白质产物的基因，分为正、负两类。操纵基因: 接受来自调节基因合成的调节蛋白的 作用，使结构基因得以抑制的DNA区段，也称控制单元操纵子的调控模型。操纵子由启动子、操纵基因和它的结构基因共同组成一个基因的复合单位，是转录调控的基本单元。其调控是通过RNA聚合酶、启动子、调节蛋白和效应物相互作用实现的。根据调节蛋白来分：负控制系统：调节蛋白(阻遏蛋白)因子出现，关闭操纵子(相对安全，宁多勿缺) 正控制系统: 有调节蛋白(诱导子)因子，操纵子开放。根据小分子物质反应来分：可诱导型操纵子：小分子物质(诱导物)出现，操纵子关闭开放.可阻遏型操纵子：小分子物质(阻遏物)出现，操纵子开放关闭调节子：一种调节蛋白可控制一个至几个操纵子的调节系统；顺式作用元件：即与调控蛋白结合的特异DNA序列。它们不合成RNA或蛋白质，直接对基因表达产生调控作用，与结构基因位于DNA分子或同一染色体上，如启动子、增强子、沉默子。刺激子：对同一环境刺激因子反应的操纵子群。反式作用因子：由特定的DNA序列编码的蛋白质或RNA，通过与启动子序列结合以及转录起始复合物相互作用，以间接方式调控基因的表达，如普遍性转录因子、转录激活因子。转录因子：结合到特异的顺势作用元件上的反势作用蛋白。转录因子包含2个结构域：识别和结合顺势作用元件目标位点结构域；组织其他参予转录激活的附加蛋白的结构域。有些转录因子必须和其他蛋白质相互作用，形成转录起始复合体(transcription initiation complex)在结合到启动子上。基因的反义控制：主要用于基因表达功能的研究以及基因定位和表达量的监测，为肿瘤病、病毒性疾病等的预防和治疗提供了重要的武器。反义RNA与引物RNA互补，抑制DNA复制；反义RNA与mRNA互补，阻止RNA翻译，促进RNA降解。真核生物基因表达调控模式：真核生物基因表达调控可分为DNA水平，转录后水平、转录后RNA的加工水平和翻译水平等多个层次。1.细胞分化是基因表达调控的结果，并不涉及遗传物质的丧失。2. 一些基因受到发育程序的严格控制，并且只在特定的组织或器官中有活性；3. 一些基因环境控制，只在某种特定的环境条件下才有活性。4. 基因中的顺势作用元件帮助协调基因表达；5. 转录因子和启动子元件相互作用促进转录。感受应答调控模式的基本原理两种方式。构成基因的重复结构：不同类型的细胞有选择地表达重复基因的特定拷贝，将拷贝置于细胞特异性表达调控网络中。感受应答模型(Britten-Davidson模型)：是真核生物基因表达调控的基本特征。形成单一拷贝基因的复合控制，参与真核基因表达调控的转录调控。蛋白因子经内源或外源信号分子诱导激活后，特异性地与单拷贝 基因的上游顺式调控元件结合，从而以某种方式大幅度提高转录启动频率。RNA聚合酶II复合体结构。各种通用的转录因子必须顺序结合到基因的启动子上，形成RNA聚合酶II复合体才可以启动转录。调节基因：远离结构基因。受信号分子调控，编码产物为转录调控因子。应答元件：一个或多个，在启动子和增强子上游，与具有活性的转录调控因子识别并结合。感受位点：在调节基因上游，一个或多个，负责接受细胞内信号分子的信息传递。酶：是细胞产生的，具有催化能力的生物催化剂。酶分为6类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类和连接酶类。核酸水解酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。RNAase：专门水解断裂RNA分子的叫核糖核酸酶；DNAase：特异性水解断裂DNA分子的为脱氧核糖核酸酶；Exonuclease：核酸外切酶，从核酸分子的末端开始，逐个水解核酸分子，降解多核苷酸链；Endonuclease：核酸内切酶，从核酸内部切割磷酸二酯键，使多核苷酸链断裂为小片段。核酸限制性内切酶：是一类能够识别DNA双链分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。主要从原核生物中分离纯化。发现两种：核酸内切酶，甲基转移酶。核酸内切酶：破坏外源DNA，使之迅速降解；甲基转移酶：保护自身DNA不受限制。核酸限制性内切酶的命名法如E co R I四部分分别代表：属名第一个字母。种名头两个字母。菌株;同一寄主菌株不同R/M体系。划线为寄主物种名。II型核酸内切酶的基本特征（3个）：1.有特异的DNA识别序列：连续GATC，不连续GANTC ；2.识别序列一般为4-8bp的回文序列，富含GC：PstI 5-CTGCAG-3， 3-GACGAG-5；3.识别序列中碱基被甲基化修饰后，会影响部分酶的切割作用。核酸内切酶的切割方式。 II型酶切割序列大多位于识别序列中，就其切割位置产生的末端，可分为3类：5-黏端、平端和3-黏端。根据其识别位点和切割方式之间的关系，可分为4类： 1.识别序列不同，切割方式不同；2.识别序列不同，产生黏端相同，称作同尾酶，如BamHI、BclI、Sau3A和XhoI产生均GATC黏端，它们产生的黏端通过互补可形成杂种位点.3.识别序列相同，切割方式不同，如SmaI、XbaI CCCGGG .4.识别序列相同，切割方式相同，称为同裂酶，如BamHI和BglII、HpaII和MspI影响核酸内切酶活性的因素。DNA纯度与结构；DNA甲基化程度；反应温度；反应缓冲液；反应体积和甘油浓度DNA聚合酶：将脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3- OH末端，催化核苷酸的聚合。依赖于RNA的DNA聚合酶：也称为RNA指导的DNA聚合酶或反转录酶。已从许多RNA肿瘤病毒中分离，目前最常用的是来源于鸟类骨髓细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus, AMV)的反转录酶。主要用于DNA互补链的合成。DNA连接酶(ligase):催化2条链3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键。能封闭nick，而非gap；反应温度：37为最佳温度，26反应4小时，4过夜；连接方式：黏性末端DNA片段的连接；DNA连接酶(ligase):催化2条链3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键。分子内连接方式。平末端DNA片段的连接同聚物加尾法：采用末端脱氧核苷酸转移酶，不需要模板，在反应体系中加入一种脱氧核苷酸，即可在3-OH形成poly(dN)尾巴。衔接物(linker)连接法：采用化学合成法合成一段由10-12个核苷酸组成，具有一个或数个酶切位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。双衔接物(linker)连接法：DNA片段两端分别连接含有不同酶切位点的接头。适用于量少片段，具有基因定向插入、防止自连和方便以后的克隆操作等优点。DNA接头连接法：DNA片段自身含有与接头相同的酶切位点的。）碱性磷酸酶：去除DNA、RNA、NTP、dNTP的5-P，可防止片段自身环化，常用的有细菌碱性磷酸酶BAP与小牛肠碱性磷酸酶CIAP。（去磷酸化）末端脱氧核苷酸转移酶：1.同聚物加尾。2.DNA测序时，在DNA末端加如同位素标记的双脱氧核苷酸进行DNA片段3-末端标记，并终止链的延伸。（不依赖模板）。S1核酸酶：底物ssDNA ，ssRNA，用途去除黏端产生平端、打开发夹结构。核酸杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混在一起， 相应的同源区段将会退火形成双链结构。1，Southern blotting（DNA+DNA）2， Northern blotting（RNA+DNA）3，Eastern blotting( 蛋白质) 4，斑点(dot)印迹杂交和狭线(slot)印迹杂交5，菌落或噬菌斑杂交6，原位杂交7，DNA芯片杂交细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。供体菌株：提供转化DNA的菌株.受体菌株：接受转化DNA的菌株大肠杆菌的转化原理：正在生长的大肠杆菌在0加入到低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀形成原生质球，同转化混合物DNA形成一种粘在细胞表面对DNAase抗性的复合物。42热刺激期间，复合物被细胞吸收。在富营养培养基中生长一段时间使抗生素抗性基因表达后，再涂布到选择培养基中筛选转化子。Sanger双脱氧链终止法原理 :DNA聚合酶以ssDNA为模版，合成互补链；以2，3-ddNTP为底物，加到3末端，从而终止链的生长。Maxam-Gilbert化学修饰法原理：用化学试剂处理DNA末端具有放射性标记DNA片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度DNA链反应化混合物，经电泳大小分离和放射自显影后，可根据X-光片显示相应谱带，直接读序即可。DNA测序的自动化（分析与读片）原理：基于Sanger双脱氧链终止法，用4种不同的荧光染料分别标记不同的双脱氧核苷酸碱基，通过毛细管进行电泳，然后通过激光激发荧光，进行测序。程序：待测序DNA+测序引物+dNTP+Bigdye标记的dNTP-PCR-产物纯化-上样测序寡核酸的生物合成:用klenow大片段，以ssDNA为模板，加入dNTP条件下合成。用于合成特定序列的寡核苷酸探针。寡核苷酸化学合成的实际用途: 1.合成基因：在了解蛋白质序列的前提下进行，如人生长激素、干扰素、胰岛素等。2.合成探针：用于筛库、基因芯片。3.合成引物：PCR、分子标记。4.合成衔接物和接头。基因扩增包括：1.在体外应用PCR技术，迅速大量扩增特定基因；2.通过体外重组，将目的基因插入高拷贝质粒，并转入相应细胞，从而目的基因随质粒拷贝数的增多而扩增；3.外界因子的胁迫下导致真核生物细胞保卫基因明显扩增；4.真核生物在特定发育阶段进行程序性基因扩增；5.在生物进化过程中发生基因的加倍和扩增，产生基因簇(clusters).PCR引物：引物1即Waston与正义链；引物2即Click与反义链即模版链。 PCR技术的特点。指导特定DNA序列的合成。特定DNA序列迅速大量扩增 ；30个循环，理论上可达109，实际106-107PCR产物克隆方法。平端连接：由于Taq酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在DNA分子3段额外加A。因此可采用：T-vector；补平或切平，在采用平端连接法。黏端连接：设计引物时加上酶切位点：引物中部或5端定点突变，设计酶切位点；5端加长3-4bp，以利于内切酶与PCR产物稳定结合。RT-PCR与RNA分析。原理：假设反映产物量同反应其始模版量成正比。因此根据琼脂糖凝胶电泳中样品条带强度比较，即可确定PCR产物及模版间的数量关系。作用：用于mRNA定量分析，较northern杂交而言，灵敏度高，所需mRNA量少，可进行低丰度的mRNA分析。可以分析不同组织、相同组织不同发育阶段某基因的表达活性，用于研究低表达活性基因mRNA生理变化动态。生物学标记：形态学标记：表型。 细胞学标记：核型，带型，染色体变异同工酶即催化同一反应但具有不同分子形式的酶DNA分子标记：利用DNA水平上的多态性进行，实质是特定DNA序列，可用于构建遗传图谱；基因定位、生物进化、分类研究。标记基于自然变异。RFLP ：即限制性片段长度多态性。原理：限制性内切酶的特异性酶切位点，长度不一DNA片段。同源序列杂交（即探针，来自随机基因组和 cDNA克隆）。DNA指纹：对于特定DNA/限制性内切酶组所产生的片段特异性。RAPD ：即随机扩增多态。原理：10bp随机引物进行PCR扩增。流程：DNA-PCR扩增 -电泳-分析。AFLP：即扩增片段长度多态。原理：AFLP和RAPD技术结合SSR：即简单重复序列，又称微卫星(microsatellite DNA)，是一类由几个核苷酸（1-6个）为重复单位基因簇集而成的长达几十个串联重复序列。原理：SSR重复次数不同，DNA片段长度不同根据侧翼保守序列设计特异性引物。引物来源：1.从数据库或有关文章查询2.使用近缘物种的引物3.构建核基因组文库，筛选SSR 4.试剂盒。流程：设计引物-PCR-电泳-分析。作用：1.构建遗传图谱2.致病基因诊断3.法医鉴定DNA分子标记优点：标记基于自然变异；不依赖于基因表达；不依赖于基因互作；不受表型效应影响；不受环境、生理因素、组织器官和发育阶段影响。 根据目的分为：研究基因编码区的氨基酸序列或在原核系统中表达的真核基因cDNA. 研究目的基因表达调控有关序列或mRNA中没有的序列DNA。基因组DNA的片段化。双酶消化：如HaeIII + AluI。单酶局部消化：Sau3A机械切割：超声波、高速搅拌基因工程常用载体。克隆载体: 主要用于克隆基因，可实现基因插入、扩增与保存；表达载体: 主要用于基因表达研究，实现基因插入、表达；共整合载体: 用于基因插入基因组。质粒载体：在细菌中能独立于染色体外进行自我复制的双链环状DNA分子。（近来研究发现也可为链状、有些甚至是RNA分子。）特点：分子量尽可能小（转化效率高）；具有复制起点（使质粒在体外复制）；高拷贝（便于扩增）；标记基因（区分转化子，非转化子；筛选重组子，非重组子）；多克隆位点MCS（便于基因插入）。标记基因: 新陈代谢特性, 如LacZ, 在IPTG诱导下表达-半乳糖苷酶，催化X-gal形成一种蓝色化合物。重要的大肠杆菌载体。pSC101（9.09kb）：第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。pBR322质粒载体：分子量小，4363bp；可克隆6kb以内DNA片段；具有两个选择标记；拷贝数高，可达1000-3000。pUC系列质粒载体： 分子量更小，2686bp；更高拷贝数；具有MCS；适于组织化学法检测重组体。穿梭质粒载体: 一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同寄主细胞（真核和原核）中存活和复制的质粒载体。柯斯质粒载体(cosmid):是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体；特点：噬菌体特性，可侵染细菌；质粒特性，在寄主细胞中复制；常具抗性基因；高容量克隆能力(30kbDNAGUGUUG ；SD与起始密码子的距离及碱基组成：6-8bp，bp时最高；AAAA or UUUUCCCCGGGG；基因编码区5序列：尽量避免与RBS互补 转录增强子: T4噬菌体基因10的前导序列大肠杆菌atpE基因的mRNA分子5-UTR端富含U的区段 转译终止子：常采用安装3个终止密码子,大肠杆菌偏爱UAAU.常用的大肠杆菌表达载体。LacZ启动子的表达载体在诱导物乳糖或IPTG诱导下,启动表达。trp启动子的表达载体被IAA和3-吲哚丙烯酸诱导；PL启动子的表达载体：受温度诱导.外源蛋白在E. coli中的表达部位：细胞质中表达。外源基因高表达时一般形成包涵体:存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白聚集折叠而成的晶体结构。周质中表达。周质：指大肠杆菌一类革兰氏阴性细菌中位于内膜和外膜间的细胞结构部分。胞外表达。融合蛋白表达。fusion gene：通过自发突变时间或通过DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。fusion protein：克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一多肽序列，也称hybrid protein 或chimeric protein。表达融合蛋白的策略的优点：RBS和编码起点的核苷酸序列由天然大肠杆菌序列构成外源基因有效转译；存在大肠杆菌多肽片段，蛋白质可免受蛋白酶的降解，产物稳定，产率提高；存在大肠杆菌多肽片段，有可能作为信号肽指导运输；存在大肠杆菌多肽片段，可用亲和层析技术分离和纯化蛋白。融合蛋白的切割：化学切割：溴化氰；甲酸；羟胺。酶催切割：胶原酶；Xa因子；凝血酶；胰蛋白酶；枯草蛋白酶酵母菌的宿主系统酵母属（酿酒酵母）克鲁维克酵母属（乳酸克鲁维克酵母）毕赤酵母属（巴斯德毕赤酵母）裂殖酵母属（非洲酒裂殖酵母）；汉逊酵母属（多态汉逊酵母）酵母菌载体系统。分类：整合型，如巴斯德毕赤酵母、多态汉逊酵母表达载体；附加型，如酿酒酵母标记基因（营养缺陷型：包括营养成分合成基因；）常规酵母表达系统-重组质粒不稳定（拷贝数与产量）；工业化生产时，产量较低；蛋白质过度糖基化，引起抗性；不能表达所有蛋白。指酿酒酵母和栗酒裂殖酵母；非常规酵母表达系统-甲醇酵母；多形汉逊酵母；克鲁维克酵母.YAC文库：由Murray等于1983首次构建，1987Burke等首次构建了人基因组的YAC分子克隆文库。真核生物基因组制图；人类致病基因克隆与分离；直接转化哺乳动物细胞，研究基因的表达与调节。酵母双杂交系统-也称为相互作用陷井，是于上世纪90年代初期发展的一种敏感的体内鉴定基因的方法。它可以高效分离能与一种已知靶蛋白(target protein)相互作用的蛋白质的编码基因。 基本原理：许多真核基因的转录激活因子(transcriptional activitor)由两个结构可以分开、功能上相互独立的结构域(domain)组成：N端DNA-BD：识别其效应基因的上游激活序列UAS，并结合；C端DAN-BD：与其它成分结合，启动UAS下游基因表达。 酵母双杂交体系的宿主菌株及质粒载体-目前酵母双杂交体系一般采用酵母：真核细胞，表达的蛋白可在细胞核相互作用；酵母容易转化，操作简单；能同时容纳两种质粒，提取质粒比较方便；有很多营养缺陷型菌株，筛选转化子容易；通过lacZ进行蓝白筛选。常采用GAL4缺陷型菌株，如SFY526、HF7C，带有特定的报告基因LacZ、HIS3和LEU4。质粒载体-两种穿梭载体：pGBT9（DNA-BD质粒载体）-杂种蛋白1；pGAD424（AD质粒载体）-杂种蛋白2。转基因动物：由人工方法将外源基因导入动物细胞，使外源基因与动物染色体整合，并随细胞的分裂而增殖，从而外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。转基因：指在外源DNA操作过程中整合到动植物受体细胞染色体上的外源基因，也指整个遗传转化过程。转基因生物制品：含有转基因并被其修饰了的动植物个体。动物转基因的结构。基因组片段 ，小基因，融合基因，靶基因，插入基因，置换基因动物转基因的表达特性。转基因的时空特异性表达；转基因的可控性表达；转基因的抑制效应共抑制效应：当受体细胞染色体上含有转基因的同源基因时，二者表达均受到抑制。具有以下特征：只发生在目的基因和同源基因间；如转基因与体内同源基因发生重组，共抑制效应消失;共抑制发生与结构基因编码区有关，不依赖于启动子；两个相同的转基因间也发生共抑制。动物转基因的生物学效应。1研究基因的结构、功能和调控：以报告基因为转基因探测动物或人类基因组中的时空特异性表达调控序列；以反义基因为转基因灭活相关的内源基因，构建基因表达功能丧失的动物模型，以筛选鉴定人类功能性基因，为基因药物提供实验实体；以同源基因为转基因，体内检测其表达特性及产物的生物效应。2动物改良；3 动物反应器；4提供异种器官转基因导入动物体内的方法。1 转基因的动物体细胞系统2 遗传选择标记 3 动物细胞的物理转化法4 动物病毒转染法电穿孔(electroporatior)DNA 转移技术。原理：在高压脉冲作用下是细胞膜出现微小的孔洞，促使细胞吸收外源DNA。脂质体是一种人造的脂质小泡，外周为脂双层。内部是水腔。脂质体转载法由脂质体介导将外源DNA导入细胞的方法，即为脂质体转载法，也叫脂质体转染法。动物病毒转染法通过病毒感染的方式将外源DNA导入动物细胞内是一种最常用的转基因方法，具有：动物病毒启动子能被真核生物识别，有效启动；许多病毒可持续复制，基因数相当高；有些病毒具有控制自我复制的顺势作用元件和反势作用因子；有些病毒能稳定整合于寄主染色体上；病毒的外壳蛋白能识别细胞接受器，可将DNA高效注入寄主细胞。哺乳动物表达载体应具有：动物细胞中的复制起点；筛选标记；外源基因表达的全部顺势作用元件；MCS；细菌质粒复制起点和抗性基因工程胚胎干细胞法（细胞介导法）多效性胚胎干细胞(ES): 小鼠胚胎发育至卵泡阶段，细胞可在体外培养基上增殖后，重新输回胚胎后，仍具有分化能力。转基因纯合体的扩增方法：常规育种法；胚胎切割法；体细胞克隆法。利用同源基因灭活细胞内源基因作用：基因打靶；动物改良；人体基因治疗基因打靶是一项高新生物技术，是指在生物体内诱发精确、定向的基因删除或替代，而不累及其他基因，即基因剔除和基因替换。分子基础：两条具有同样或类似核苷酸序列的同源DNA分子间发生的遗传信息的重组事件。利用反义基因抑制细胞基因表达方法一 分离靶mRNA | 细菌RNA聚合酶 反义RNA | 注入细胞 形成dsRNA |促进mRNA降解方法二 靶基因DNA序列 |一小段反义DNA | 与mRNA 5端互补 | 抑制翻译 受体鼠 供体鼠 外源基因 / / 转染 卵母细胞 体细胞 | | 去核 挑选阳性细胞，取核 / 核卵重组，电激活 | 体外培养 | 植入假孕小鼠 | 转基因克隆鼠 | 重复克隆体细胞克隆技术：又称为核移植或无性繁殖技术，是通过特定的人工手段（显微操作、电融合等），对特定发育阶段的核供体（胚胎分裂球或体细胞核）及相应的核受体，不经过有性繁殖过程，进行体外重构，通过重构胚的胚胎移植，从而达到扩大和繁殖同基因型哺乳动物种群的目的。动物反应器：即动物个体表达系统，用于生产生物大分子的转基因动物。基因治疗的基本战略思想：用正常基因取代病人细胞（生殖细胞和体细胞）中的缺陷基因。基本内容分为：基因诊断；基因分离；载体构建；基因转移。体内疗法：各种组织、器官、血液等感染或直接注射缺陷型重组病毒；重组DNA 分子直接注射横纹肌，如骨骼肌和心肌等；由呼吸道直接吸入气溶胶；基因枪轰击器官、组织和细胞等；电穿孔导入。体外疗法：病变细胞 | 体外培养 重组病毒 / 转化，进行遗传修饰 | 检测 |输回患者体内基因治疗的分子机制正常基因：同源置换病变基因；反义基因：mRNA互补；自杀基因：编码产物为自杀酶，可将无毒代谢物转化为有毒物质，杀死细胞。目的基因类别：抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、改良木质素基因、抗逆基因、抗环境污染基因等。 主要用于植物遗传转化的抗虫基因主要有：Bt毒蛋白基因、植物蛋白酶抑制剂基因、昆虫特异性神经毒素基因。植物基因转化受体系统，是指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。 植物基因转化受体系统的类型及其特性。植物基因转化受体主要是器官发生和体胚发生。器官发生是指植物外植体或细胞团直接再生为完整的植株。而体胚发生则是从单个细胞诱导为胚性细胞，进而成为胚，再生为完整植株，与种子萌发相似，因此被称为人工种子。 愈伤组织再生系统：外植体经脱分化培养诱导愈伤组织，并通过分化培养获得再生植株的受体系统。特点：脱分化的分生细胞易于接受外源基因，转化率较高；扩繁量大，可获得较多的转化植株；多种组织、器官均可诱导愈伤；通过该系统获得的再生植株变异大，外源基因稳定性较差；嵌合体多。 原生质体再生系统。原生质体是“裸露”的植物细胞，具全能性，在适当的条件下可再生植株。特点：无细胞壁，可直接高效吸收外源DNA；单细胞起源，嵌合体少；易于同等控制条件下进行准确的转化与鉴定；适用于多种转化系统；经历繁复操作，遗传稳定性更差；建立相当困难。 生殖细胞受体系统。花粉粒、卵细胞为受体，主要以两个途径进行转化：利用组培技术进行单倍体培养，诱导胚性细胞或愈伤；直接利用花粉和卵细胞受精过程进行转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法和子房微注射法。特点：受体细胞具全能性，接受外源基因能力强，一劳永逸。单倍体受体，无现隐性影响，有利于性状选择，通过加倍后即为纯合体，缩短选育纯化过程；利用植物自身的授粉过程操作简单、方便，将现代分子育种和常规育种紧密结合，具有潜力；受季节限制，无性繁殖的植物不宜采用。 植物基因转化受体系统的条件高效稳定的再生能力；较高的遗传稳定性；具有稳定的外植体来源；对选择抗生素敏感；对农杆菌浸染有敏感性器官发生受体系统特点：获得再生植株周期短，操作简单；体细胞无性系变异小；更适用于林木；建立较困难；嵌合体多。 体胚发生受体系统 。接受外源DNA能力强，是理想的基因转化感受态细胞；繁殖量大，同步性好，转化后的胚性细胞即可发育成转基因的胚状体及完整的植株，因此此受体系统的转化率和转化效率都很高。体胚发生多是单细胞起源，转化获得的转基因植株嵌合体少；体胚发生具有两极性，即在发育过程中可同时分化出芽和根形成完整植株；个体间遗传背景一致，无性系变异小，胚的结构完整；繁殖效率高、可通过生物反应器进行大规模生产，因此可利用转基因的体细胞胚生产人工种子，成苗快，数量大，有利于转基因植株的生产和推广。高频再生系统建立。必要条件：1）具有再生完整植株的能力，最好直接分化芽；2）芽分化率达90%以上；3）易于离体培养，可重复；4）变异小。外植体的选择（幼年型、增殖能力强、萌动期、强再生能力的基因型、遗传稳定性好）；最佳培养基的确立目前转基因技术大致可分为三大类：生物学方法主要有农杆菌介导、花粉管通道法等；物理法有基因枪、电激、显微注射、激光和碳化硅纤维等；化学法包括磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇（PGE）和脂质体等。 基因枪法将DNA包被在钨粉或金粉颗粒中，火药爆炸产生的动力将DNA打入细胞。后来人们又相继设计出以高压气体和高压电容放电作为动能的基因枪，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞的核中整合并表达，精度得以提高。 转基因方法比较：农杆菌介导法。经济、简便、高效，多为单拷贝整合；受体系统限制。基因枪法。适用范围广；昂贵、转化效率低、多拷贝。显微注射法。转基因植株为纯合体；费时、费力，技术要求高。电穿孔法。适用范围广；仪器昂贵，仅限原生质体。PEG法。经济；仅限原生质体。花粉管通道法。直接收获T1代种子；费时、工作量大。超声波辅助法。高效，适用范围广，多为单拷贝整合。农杆菌介导的遗传转化载体系统分为根癌农杆菌和发根农杆菌两种。 转基因技术大致可分为三大类：生物学方法主要有农杆菌介导、花粉管通道法等；物理法有基因枪、电激、显微注射、激光和碳化硅纤维等；化学法包括磷酸钙-DNA共沉淀、聚乙二醇（PGE）和脂质体等。 植物表达载体一般结构植物基因转化载体是指用于目的基因导入植物细胞的载体，也有人称之为植物表达载体。最常用的载体是以质粒形式存在的，通常包含以下几个部分： 宿主菌的复制子；多克隆位点；选择标记基因；报告基因；外源基因表达框：外源基因、启动子和终止子。植物转化相关的边界DNA序列；顺式调控元件。共整合载体系统是利用同源重组的方式，将目的基因插入到卸甲，即去除T-DNA的边界顺序间的致瘤基因)的Ti质粒上，形成共整合体，转化时由同一质粒上的vir基因序列表达，从而驱动目的基因序列的转移，将外源基因整合到植物细胞基因组中。目前常见的共整合载体系统有pGV3850，pGV3851，GV311-SE(C024)系统。 双元载体系统中，存在起辅助作用的卸甲的Ti质粒（寄生于农杆菌中，有vir基因而缺乏T-DNA区，可提供反式毒性功能）和双元载体或微型Ti质粒（含Ori-Ecoli和Ori-Agro，可穿梭于大肠杆菌和农杆菌之间）。它无须同源重组，相对较小，可容纳更长(10kb以上)的外源DNA。目前，绝大多数的农杆菌转化均用双元载体系统，较常用的有LBA4404(pBinl9 ,pBI121 等。 发根农杆菌介导的遗传转化载体系统。优点： Ri质粒可以不经“卸甲”直接进行转化；Ri质粒转化植物所产生的发状根来自于单细胞克隆；通过转化毛状根的扩大培养，获得重要的次生代谢物质；毛状根再生植株常会呈现特殊的外观形态，转化体筛选方便。 植物叶绿体转化载体系统。优越性：叶绿体具有基因拷贝数高等特点，可以大量地表达外源基因；叶绿体大多数基因的结构、转录与翻译系统均与原核生物类似；叶绿体遵循母系遗传规律，具有较大的安全性，同时后代将永远保持为纯系，不会因为有性杂交而发生分离；叶绿体基因组小，结构简单。植物细胞直接转化载体系统。缺点：转化率低；转基因遗传不稳定；转化过程中各种条件和参数难以把握。优点：无单子叶与双子叶植物的限制；不受受体植物基因型的制约；载体来源广泛，构建相对简单；某些生殖器官直接导人外源基因避开了组织培养和植株再生过程。 病毒转化载体系统植物病毒载体系统是将外源基因插入到病毒基因组中，通过病毒对植物细胞的侵染将外源基因导入植物细胞，实现外源基因在植物细胞内的快速表达，从而在植物细胞中大量制造外源蛋白的一种系统。外源基因借助于病毒进入植物细胞，与病毒基因组的基因同步复制与表达，并不整合到植物基因组中，因此植物病毒载体系统并非是一种整合载体系统。农杆菌介导法(Agrobacterium) 。植物冠瘿发生的分子机理：很久以前，人们就发现在自然界，根癌农杆菌(Agrobaterium tumerfaciens)能感染许多双子叶植物和少数几种单子叶植物的受伤部位，一个月内就能在受伤处长出一团帽状组织，即冠瘿瘤，严重危害植物生长的病害。为什么根癌农杆菌会诱发冠瘿呢? 原来，在农杆菌中存在着一类专一性诱瘤质粒，即Ti质粒(tumour inducing plasmid)。Ti质